背景^[1-3]

T-47D人乳腺管癌細(xì)胞分離自一位54歲乳房侵入性導(dǎo)管癌的女性患者胸水；發(fā)現(xiàn)分化的上皮亞株(T-47D)有細(xì)胞質(zhì)連接和17-β-雌二醇及其他類固醇降血鈣素的受體，T-47D細(xì)胞表達(dá)WNT7B癌基因。

T-47D人乳腺管癌細(xì)胞

培養(yǎng)步驟

培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；添加0.01mg/ml胰島素；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于藏藥毛訶子化學(xué)成分及體外抗癌活性的研究

從毛訶子中分離得到;有35個(gè)單體化合物為首次從欖仁樹屬植物中分離得到,且二氫黃酮類和縮合鞣質(zhì)類為首次從欖仁屬植物中分離得到。采用UPLC-MSn液質(zhì)聯(lián)用分析毛訶子乙酸乙酯部位和水部位化學(xué)成分:ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm,1.7μm）色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-0.2%冰醋酸水溶液,梯度洗脫（0-5 min,5%A→15%A;5-10 min,15%A→25%A;10-15 min,25%A→60%A;15-25 min,60%A→90%A;25-30 min,90%A→90%A）,流速0.3mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm和280 nm,柱溫30℃。

根據(jù)ESI-MS提供的精確分子量、UPLC-MSn產(chǎn)生的MS/MS裂解碎片、各化合物的相對(duì)保留時(shí)間（tR）、推測(cè)的分子式（error<±5 ppm）等信息以及已有文獻(xiàn)的報(bào)道,共推測(cè)出到70個(gè)化合物,乙酸乙酯部位推測(cè)出48個(gè)化合物,水部位推測(cè)出22個(gè)化合物,其中14個(gè)單體化合物分離得到。

另外,總結(jié)沒食子酸及其酚酸類衍生物、鞣花酸及其酚酸類衍生物、可水解鞣質(zhì)的質(zhì)譜解析規(guī)律。采用CellTiter-Blue?Cell Viability Assay法,對(duì)藏藥毛訶子不同極性萃取部位的抗癌活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。選用人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞（ZR 75-1）、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞（BT-474）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人乳腺癌細(xì)胞（T-47D）、人結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞（Colo-205）、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（HT-29）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）、人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞（Hec-1-A）、人前列腺癌細(xì)胞（LnCap）和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）10種癌細(xì)胞為模型,比較藏藥毛訶子不同極性部位的抗癌活性。

結(jié)果表明,藏藥毛訶子乙酸乙酯萃取部位和水萃取部位抗癌活性較強(qiáng),乙酸乙酯萃取部位對(duì)ZR 75-1、Colo-205、BT-474和T-47D癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為27.33μg/mL、36.63μg/mL、5 0.67μg/mL和53.47μg/mL;水萃取部位對(duì)T-47D和Colo-205癌細(xì)胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為35.98μg/mL和55.17μg/mL。

參考文獻(xiàn)

[1]Distribution of Metabolites in Root Barks of Seven Tree Peony Cultivars for Quality Assessment Using NMR-based Metabolomics[J].Pei Wang,Ze-ming Rong,Cui-xia Ma,Xin-feng Zhao,Chao-ni Xiao,Xiao-hui Zheng.Chinese Herbal Medicines.2017(1)

[2]Ellagitannin oligomers and a neolignan from pomegranate arils and their inhibitory effects on the formation of advanced glycation end products[J].Hideyuki Ito,Peng Li,Mayuko Koreishi,Akifumi Nagatomo,Norihisa Nishida,Takashi Yoshida.Food Chemistry.2014

[3]Anti-Helicobacter pylori compounds from the ethanol extracts of Geranium wilfordii[J].Xi-Quan Zhang,Hong-Mei Gu,Xin-Zhu Li,Zhong-Nan Xu,Yu-Sheng Chen,Yang Li.Journal of Ethnopharmacology.2013(1)

[4]TLC Densitometric Methods for Quantification of Gallic Acid in Triphala Churna for Routine Quality Control[J].Vishal Jain,Ambar Vyas,Swarnlata Saraf,S.Saraf.Research Journal of Pharmacy and Technology.2011(2)

[5]李師.藏藥毛訶子化學(xué)成分及體外抗癌活性的研究[D].北京中醫(yī)藥大學(xué),2018.