背景[1-3]
大鼠晶狀體上皮細(xì)胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來；細(xì)胞經(jīng)BFSP2免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
大鼠晶狀體上皮細(xì)胞分離自晶狀體組織；晶狀體源自胚胎發(fā)育外胚層，僅含有上皮細(xì)胞及其產(chǎn)物，晶狀體囊膜作為屏障將晶狀體與其它類型細(xì)胞完全分開；因而，晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)既無神經(jīng)和血管組織的干擾，又不受其它類型細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的污染，保證了培養(yǎng)中細(xì)胞成分的單一性。
大鼠晶狀體上皮細(xì)胞
晶狀體上皮細(xì)胞主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)晶狀體的生理平衡，包括電解質(zhì)和液體的輸送。在正常的發(fā)育過程中，晶狀體上皮細(xì)胞分化和成熟，然后遷移到晶狀體內(nèi)部，產(chǎn)生晶體蛋白，自身也拉長而變成晶狀體纖維細(xì)胞，并最終失去細(xì)胞核和其它的細(xì)胞器。研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞的分化和極化受到了眼部液體中的生長因子的調(diào)控，包括表皮生長因子和胰島素等。
細(xì)胞貼壁后為扁平不規(guī)則多角形，呈單層生長、連成膜狀。晶狀體上皮細(xì)胞是緊密貼附于晶狀體前囊內(nèi)表面的單層上皮細(xì)胞，其異常增殖和分化與白內(nèi)障和后囊混濁的發(fā)生密切相關(guān)，體外培養(yǎng)是研究其生長規(guī)律的主要手段。
操作方法
1.取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
2.待細(xì)胞達到80%匯合時準(zhǔn)備進行傳代培養(yǎng)。
3.細(xì)胞傳代
1)吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴1min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；
3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
應(yīng)用[4][5]
用于槲皮素對糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響研究
通過觀察槲皮素（QUE）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）凋亡及其凋亡調(diào)控基因bcl-2、bax表達的影響,探討槲皮素對糖尿病大鼠晶狀體的保護作用。
方法:1、體重150g-180g雄性SD大鼠60只,經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查排除雙眼晶狀體病變及其它眼部疾病。適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后禁食12h,不禁飲,隨機抽取40只予以腹腔注射1%鏈脲佐菌素,剩余20只大鼠則設(shè)置為正常對照組（對照組）,腹腔注射等體積0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液。72h后尾靜脈取血,測得空腹血糖≥16.7mmol/L為造模成功。
2、將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組（糖尿病組）和槲皮素干預(yù)組（槲皮素組）。自造模成功第二天起,槲皮素組每日給予槲皮素50mg/kg灌胃,糖尿病組和對照組每天給予等體積0.5%羧甲基纖維素（CMC）灌胃。實驗過程中對大鼠飲食、飲水、尿量、精神等一般情況進行每日觀察及記錄,每周稱量體重1次并記錄,每2周檢測血糖1次。
3、使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液給以大鼠雙眼充分散瞳,采用數(shù)碼裂隙燈顯微鏡每周1次對各組晶狀體混濁程度進行觀察并記錄。分別于STZ注射后4周、8周處死各組大鼠5只,12周時處死各組剩余大鼠。摘除眼球,分離晶狀體,每組各時間點取5只晶狀體用于固定包埋,制備石蠟切片用于HE染色及免疫組織化學(xué)法檢測晶狀體上皮細(xì)胞中bcl-2和bax的表達情況。各組剩余晶狀體用于制備細(xì)胞懸液檢測細(xì)胞凋亡。
參考文獻
[1]Quercetin induces human colon cancer cells apoptosis by inhibiting the nuclear factor-kappa B Pathway[J].Xiang-An Zhang,Shuangxi Zhang,Qing Yin,Jing Zhang.Pharmacognosy Magazine.2015(42)
[2]2-Chloro-1,4-naphthoquinone derivative of quercetin as an inhibitor of aldose reductase and anti-inflammatory agent[J].Ivana Milackova,Marta Soltesova Prnova,Magdalena Majekova,Ruzena Sotnikova,Michal Stasko,Lucia Kovacikova,Sreeparna Banerjee,Miroslav Veverka,Milan Stefek.Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemis.2014(1)
[3]Quercetin protects radiation-induced DNA damage and apoptosis in kidney and bladder tissues of rats[J].H.Ö,zyurt,Ö,.Ç,evik,Z.Ö,zgen,A.S.Ö,zden,S.Ç,ad&imath,rc&imath,M.A.Elmas,F.Ercan,M.Z.Gö,ren,G.&Scedil,ener.Free Radical Research.2014(10)
[4]Quercitrin protects skin from UVB-induced oxidative damage[J].Yuanqin Yin,Wenqi Li,Young-Ok Son,Lijuan Sun,Jian Lu,Donghern Kim,Xin Wang,Hua Yao,Lei Wang,Poyil Pratheeshkumar,Andrew J.Hitron,Jia Luo,Ning Gao,Xianglin Shi,Zhuo Zhang.Toxicology and Applied Pharmacology.2013(2)
[5]劉鵑.槲皮素對糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響[D].四川醫(yī)科大學(xué),2015.