背景^[1-3]

人胚腎細胞來源于以腺病毒5 DNA進行轉(zhuǎn)化的腎細胞，適于滴定人腺病毒。細胞表達一種不尋常的由整聯(lián)蛋白beta-1亞基和玻聯(lián)蛋白alpha-v亞基組成的玻聯(lián)蛋白細胞表面受體。Ad5插入片段進行了克隆和測序，結(jié)果表明堿基1-4344插入到了19號染色體（19q13.2）。293細胞比較容易轉(zhuǎn)染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結(jié)果。

人胚腎細胞

復(fù)蘇操作：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。

應(yīng)用^[4][5]

用于納米Fe3O4/Cr（Ⅵ）復(fù)合物對大腸桿菌及人胚腎細胞的毒性研究

以Cr（Ⅵ）為典型重金屬污染物的代表,利用納米四氧化三鐵吸附水中Cr（Ⅵ）,選擇大腸桿菌E.coli和人胚腎細胞HEK293兩種不同層級的生物作為模型,研究磁性納米四氧化三鐵吸附Cr（Ⅵ）離子后的復(fù)合物對兩種生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。本研究的濃度作用范圍如下:MNPs濃度為250μg/mL,Cr（Ⅵ）濃度分別為1、2、3μg/mL,MNPs吸附不同濃度Cr（Ⅵ）后的MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物,作用時間為24h。

結(jié)果如下:1.本研究采用共沉淀法,合成了納米四氧化三鐵顆粒（MNPs）,并利用MNPs吸附水中的Cr（Ⅵ）,制備了MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn),MNPs能夠有效的吸附水中的Cr（Ⅵ）離子;MNPs對Cr（Ⅵ）的吸附符合Langmuir模型。MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物呈球形,顆粒大小一致,分布均勻,單分散性好,性質(zhì)比較穩(wěn)定。

2. 在本研究的濃度范圍和作用時間下,Cr（Ⅵ）對大腸桿菌E.coli具有明顯的毒性效應(yīng),并且與Cr（Ⅵ）濃度呈劑量相關(guān)性。在Cr（Ⅵ）離子的作用下,E.coli的生長受到明顯的抑制,Cr（Ⅵ）能夠引起E.coli內(nèi)活性氧顯著升高,并導(dǎo)致氧化損傷,使細胞結(jié)構(gòu)嚴重受損。MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物對E.coli沒有顯著的毒性效應(yīng)。與空白組比較,生長曲線沒有出現(xiàn)明顯的變化,在MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物作用下,E.coli內(nèi)活性氧略微升高,但并未導(dǎo)致明顯的氧化損傷。通過透射電鏡觀察到僅有少量的MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物吸附在大腸桿菌的表面,但細胞膜的通透性及細胞結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物在LB培養(yǎng)基中都是帶負電的顆粒,且水合粒徑都在200 nm左右,導(dǎo)致MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物沒有進入到大腸桿菌細胞內(nèi),僅有少量的MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物吸附在大腸桿菌表面,盡管產(chǎn)生了少量的活性氧,但不足以導(dǎo)致細胞代謝失衡。因此,MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物對E.coli沒有產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。

3. 在本研究的濃度范圍和作用時間下,Cr（Ⅵ）對人胚腎細胞HEK293的毒性效應(yīng)顯著,并且與Cr（Ⅵ）濃度劑量相關(guān)。在Cr（Ⅵ）離子的作用下,細胞的形態(tài)和密度都發(fā)生了顯著變化,細胞活力明顯下降,同時引起細胞內(nèi)活性氧顯著升高,導(dǎo)致氧化損傷,并誘導(dǎo)了細胞的凋亡。在MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物的作用下,與空白組相比,細胞的形態(tài)、密度和細胞活力均沒有出現(xiàn)明顯的變化。

MNPs吸附Cr（Ⅵ）后,顯著降低了Cr（Ⅵ）對HEK293細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的破壞作用,MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物沒有引發(fā)細胞的氧化損傷,證實了細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)沒有受到明顯的破壞。在DMEM培養(yǎng)基中,由于MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物的水合粒徑基本都在200～400nm之間,且表面電荷都是帶負電,導(dǎo)致絕大多數(shù)的復(fù)合物不能進入細胞內(nèi),MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物在HEK293細胞內(nèi)的攝取量極小,這些顆粒是從細胞外通過質(zhì)膜內(nèi)陷形成囊泡進入細胞,但沒有進入到細胞核中,在正常代謝途徑下不會導(dǎo)致細胞的凋亡。因此,MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）復(fù)合物對HEK293細胞沒有顯著毒性效應(yīng)。

參考文獻

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