背景^[1][2]

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是在神經(jīng)生長因子被發(fā)現(xiàn)后約30年由德國神經(jīng)化學家及其同事首次從豬腦中分離純化得到，并發(fā)現(xiàn)具有防止神經(jīng)元死亡效能的一種活性多肽，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成，是由119個氨基酸殘基組成的小分子堿性蛋白質(zhì)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)BDNF對多種神經(jīng)元，如運動神經(jīng)元、神經(jīng)嵴及基板起源的感覺神經(jīng)元、黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元、基底前腦的膽堿能神經(jīng)元以及海馬、皮質(zhì)、視神經(jīng)節(jié)等處的神經(jīng)元的生長、分化及損傷后修復有促進作用。這些作用表明，BDNF具有治療一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病的潛力。但是天然組織中的BDNF含量極低，因此，通過基因工程制備重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（rhBDNF）成為相關(guān)研究的關(guān)鍵之一。

分離純化^[1]

將菌體用PBS緩沖液重復洗2次，按1∶ 10懸浮于5 mmol /L EDTA-50 mmol /L Tri s-HCl ( pH8. 0)緩沖液，冰浴超聲破碎，離心收集包含體沉淀。用低濃度脲重復洗滌2次，洗滌后的包含體溶解于6 mol /L鹽酸胍-50 mmo l /Lβ -巰基乙醇-50 mmo l /L Tris· HCl ( pH8. 0)，1～2 h。再用8 mol /L脲-50mmol /L PB( pH7. 0)透析，以脲替換鹽酸胍，經(jīng)0. 45 μm微孔濾膜過濾后樣品上樣進行柱色譜。

首先，用Wa ters 650 系統(tǒng)和CM-Sepharose FF 柱，收集的rhBDN F峰，用谷胱甘肽系統(tǒng)( 0. 2 mmol /L GSSG-1 mmol /L GSH)復性，復性液中蛋白濃度50～100 μg /ml，pH8. 0，4℃ 12～18 h。復性后樣品再用Waters Delta 4 000高壓色譜和C8 反相柱( 2 cm× 30 cm) ，進樣后，20% 乙腈(含0. 1% TFA)和90% 乙腈(含0. 1% TFA)之間梯度洗脫，流速4 ml /min，收集重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子峰，凍干。

生物活性測定^[1]

取9日齡雞胚，無菌條件下解剖去除內(nèi)臟，暴露脊髓，分離頸段和腰段背根神經(jīng)節(jié)，接種于細胞瓶中，37℃ /5% CO2下貼壁1 h，然后加入無血清培養(yǎng)基( DMEM，10 mmol /L HEPES，2 mmo l /L Gln，5 μg /ml胰島素，5 ng /ml運鐵蛋白( transferrin)，5ng /ml Na2 SeO3，20 ng /ml孕酮，1μg /ml丁二酰胺和不同濃度待測樣品，37℃ /5% CO2 繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，觀察神經(jīng)突起生長情況。以無生長因子的為陰性對照、已知濃度和活性的NGF為陽性對照，取神經(jīng)突起生長良好的BDN F終濃度來表示該樣品的活性。

鑒定^[1]

將純化得到的重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（rhBDNF）作進一步鑒定，包括Western-blot，N-末端氨基酸序列分析及其生物活性的測定。實驗結(jié)果表明，純化所得蛋白和抗-hBDNF多克隆抗體有結(jié)合特異性，N-末端有一個大腸桿菌系統(tǒng)表達蛋白常見的甲硫氨酸，第14位Cys 在測定條件下被破壞外，重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（rhBDNF）-末端序列完全一致。用雞胚背根神經(jīng)節(jié)法測定其生物活性表明，活性為50 ng /ml。

主要參考資料

[1] 牟芝蓉, 朱厚礎. 重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的純化和鑒定[J]. 生物技術(shù)通訊, 1999 (3): 171-174.

[2] 林艷麗, 彭清忠, 湯國營, 等. 重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在大腸桿菌中的可溶性表達及純化[J]. 生物技術(shù)通訊, 2005, 16(1): 19-21.