背景[1-3]
人肝癌細胞來源于一名15歲的白人少年的肝癌組織。該細胞表達甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、結(jié)合珠蛋白、銅藍蛋白、纖溶酶原、補體C4、C3激活物、纖維蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白；表達胰島素受體和胰島素樣生長因子IGFⅡ的受體；該細胞具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未證明該細胞中有HBV基因組。
細胞培養(yǎng)方法：
1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
人肝癌細胞
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。
應用[4][5]
用于蜂毒素誘導保護性自噬對人肝癌細胞生長的影響研究
以人肝癌細胞SMMC-7721、HepG2為研究對象,并建立了肝癌細胞荷瘤鼠模型,在體、內(nèi)外研究蜂毒素對人肝癌細胞自噬的誘導作用,并分別通過激活和抑制自噬觀察蜂毒素對人肝癌細胞增殖、凋亡、細胞死亡的作用,明確自噬在蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡中的作用和地位。通過對自噬、凋亡相關(guān)通路蛋白的檢測,探討蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡可能的相關(guān)作用機制,為以后蜂毒素的抗腫瘤研究提供實驗基礎和思路。
蜂毒素對人肝癌細胞增殖抑制及誘導自噬作用1、MTT法檢測不同濃度Mel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞分別作用不同時間的增殖抑制率;通過倒置相差顯微鏡觀察不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞形態(tài)變化;通過Annexin V-FIFC/PI雙染法檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞凋亡情況;通過臺盼藍染色法檢測檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞的死亡情況。
2、Western Blot分別檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h及5μg/mL Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞不同時間后,LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin 1、p62蛋白的表達;透射電鏡檢測5μg/mL Mel作用人肝癌HepG2細胞不同時間（0h、24h）后細胞自噬體的形成情況;免疫熒光檢測5μg/mL Mel對人肝癌HepG2細胞干預24 h后Beclin 1的表達;對人肝癌HepG2細胞進行pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,激光共聚焦檢測Mel對人肝癌HepG2細胞LC3的表達。
自噬機制在蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡中的作用1、MTT法、Annexin V-FIFC/PI雙染法、臺盼藍染色法檢測自噬抑制劑、自噬激活劑單獨和聯(lián)合5μg/mL Mel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞分別作用24 h后的增殖抑制率、細胞凋亡及細胞死亡情況。
2、自噬抑制劑單獨和聯(lián)合5μg/mL Mel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞干預后,Western Blot檢測Beclin 1復合物及凋亡通路相關(guān)蛋白的表達情況。
參考文獻
[1]Autophagy-deficiency in hepatic progenitor cells leads to the defects of stemness and enhances susceptibility to neoplastic transformation[J].Feng Xue,Lei Hu,Ruiliang Ge,Lixue Yang,Kai Liu,Yunyun Li,Yanfu Sun,Kui Wang.Cancer Letters.2016(1)
[2]Cancer statistics in China,2015[J].Wanqing Chen,Rongshou Zheng,Peter D.Baade,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Freddie Bray,Ahmedin Jemal,Xue Qin Yu,Jie He.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2016(2)
[3]World‐wide relative contribution of hepatitis B and C viruses in hepatocellular carcinoma[J].Catherine de Martel,Delphine Maucort‐Boulch,Martyn Plummer,Silvia Franceschi.Hepatology.2015(4)
[4]Induction of autophagy improves hepatic lipid metabolism in glucose-6-phosphatase deficiency[J].Benjamin L.Farah,Dustin J.Landau,Rohit A.Sinha,Elizabeth D.Brooks,Yajun Wu,Suet Yin Sarah Fung,Tomohiro Tanaka,Masahiro Hirayama,Boon-Huat Bay,Dwight D.Koeberl,Paul M.Yen.Journal of Hepatology.2015
[5]呂燦.蜂毒素誘導保護性自噬對人肝癌細胞生長的影響[D].中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學,2019.