背景^[1-3]

大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分離自甲狀腺組織；甲狀腺是脊椎動(dòng)物非常重要的腺體，屬于內(nèi)分泌器官。在哺乳動(dòng)物身體中，它位于頸部甲狀軟骨下方，氣管兩旁。甲狀腺表面有結(jié)締組織被膜，表面結(jié)締組織深入到腺實(shí)質(zhì)，將實(shí)質(zhì)分為許多不明顯的小葉，小葉內(nèi)有很多甲狀腺濾泡和濾泡旁細(xì)胞。甲狀腺控制使用能量的速度、制造蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)其他賀爾蒙的敏感性。

甲狀腺依靠制造甲狀腺素來(lái)調(diào)整這些反應(yīng)，有T3和T4。這兩者調(diào)控代謝、生長(zhǎng)速率還有調(diào)解其他的身體系統(tǒng)。T3和T4由碘和酪胺酸合成。甲狀腺也生產(chǎn)降鈣素，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣的平衡。其中，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞（也稱為濾泡細(xì)胞或主要細(xì)胞）是在甲狀腺細(xì)胞是負(fù)責(zé)生產(chǎn)和分泌甲狀腺激素，甲狀腺素（T4）和三碘甲狀腺原氨酸（T3）。

大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞

培養(yǎng)操作:

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；

1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

用于RCCS模擬微重力影響大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性和分泌功能的研究

釆用微重力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（the rotary cell culture system,RCCS）,研究模擬微重力對(duì)大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性和相關(guān)分泌功能的影響,為航天員在失重環(huán)境中甲狀腺應(yīng)激和病理性改變的防治提供理論依據(jù)。

研究方法應(yīng)用RCCS技術(shù)構(gòu)建FRTL-5細(xì)胞模擬微重力培養(yǎng)系統(tǒng)。將大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞FRTL-5細(xì)胞株隨機(jī)分為模擬微重力組（simulated microgravity group,SMG）和正常重力對(duì)照組（normal gravity group,NG）,分別于培養(yǎng)第6h、12 h、24 h、36 h取細(xì)胞及上清液,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)T3、T4、FT3、FT4,ELISA檢測(cè)上清液中Tg和TPO水平;應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)第6 h、12 h、24 h、36 h后細(xì)胞表面形態(tài);透射電鏡觀察培養(yǎng)12 h和36 h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);激光共聚焦顯微鏡觀察培養(yǎng)36 h的細(xì)胞微絲骨架熒光強(qiáng)度變化。

結(jié)果（1）MTT結(jié)果顯示,SMG組FRTL-5細(xì)胞經(jīng)6 h、12 h、24 h、36 h培養(yǎng)后,各時(shí)相細(xì)胞增殖均較NG組受到明顯抑制（P<0.05）,其中24 h最為明顯（P<0.01）;36 h表現(xiàn)為兩種情況,一是SMG組的細(xì)胞增殖恢復(fù),二是NG組的細(xì)胞增殖速度快速提升。

（2）流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期顯示,與NG相比,FRTL-5細(xì)胞微重力培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、36 h后G1期細(xì)胞比例顯著增高;除6 h外,S期細(xì)胞比例明顯降低;而各時(shí)相的G2/M期細(xì)胞比例表現(xiàn)為模擬失重早期（6-12 h）降低,其中12 h出現(xiàn)低谷值,24 h一過(guò)性顯著增高,36 h回落。研究結(jié)果提示,SMG組FRTL-5細(xì)胞培養(yǎng)6-12 h階段DNA合成下降,24 h的DNA合成趨活躍,而36 h的DNA合成后期比例又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)并向NG組的比例靠近。

（3）化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)結(jié)果顯示,RCCS培養(yǎng)6 h組FRTL-5細(xì)胞上清液中FT3、T4和FT4水平顯著降低（P<0.05）,其余各時(shí)相的T3、T4、FT3、FT4則未受明顯影響。

（4）ELISA測(cè)細(xì)胞上清液結(jié)果顯示,與NG相比,SMG組FRTL-5細(xì)胞Tg和TPO分泌均明顯升高（P<0.01）,表現(xiàn)為6 h即顯著升高,隨后呈下降趨勢(shì),24-36 h階段又趨上升,其中SMG組的6 h與24 h以及24 h與36 h之間有顯著差異（P<0.01）。

（5）倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示,模擬失重環(huán)境下FRTL-5細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化,實(shí)驗(yàn)早期細(xì)胞逐漸趨于死亡狀態(tài),24 h后細(xì)胞數(shù)量又有所增長(zhǎng)。

（6）透射電鏡結(jié)果顯示,模擬失重第12 h,36 h的FRTL-5細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

（7）模擬微重力培養(yǎng)36 h后,激光共聚焦顯微鏡觀察熒光素FITC標(biāo)記的FRTL-5細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微絲骨架局部解聚,張力纖維減少,結(jié)構(gòu)和排列紊亂,細(xì)胞偽足少見(jiàn),細(xì)胞形狀呈不規(guī)則。

參考文獻(xiàn)

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