背景技術(shù)
現(xiàn)有微生物實驗中篩選產(chǎn)生纖維素酶細菌的染色方法是在長出菌落的培養(yǎng)基上覆蓋濃度為1 mg/mL的剛果紅溶液，浸泡10?15分鐘或更長時間，然后倒去剛果紅溶液，再加入濃度為1mol/L的氯化鈉溶液浸泡15分鐘或更長時間，然后倒掉氯化鈉溶液，此時，能夠產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)透明圈。該剛果紅染色法特指纖維素染色法，凡是能產(chǎn)生纖維素酶的微生物均可用此方法鑒定?，F(xiàn)有技術(shù)中如果剛果紅濃度低，染色時間短的話，染不上顏色，浸泡時間短的話，透明圈不明顯，因此，現(xiàn)有方法因使用的剛果紅濃度低，需要很長時間才能染上顏色，同時浸泡洗脫時間也過長，染色和浸泡時間過長，會使菌落彌散，菌落之間發(fā)生混雜，容易交叉污染，既延長了實驗時間，也有可能給實驗造成不必要的麻煩，如果染色過程中菌落彌散的厲害，不同菌落之間有交叉，就必須在染色之前，將菌落轉(zhuǎn)移出去，再進行染色篩選，步驟繁瑣。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種能夠縮短染色和浸泡時間，降低菌落之間發(fā)生混雜，減少交叉污染機會的剛果紅染色法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:種剛果紅染色法，其步驟是:
(1)涂布接種細菌:在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基上涂布接種細菌，將涂布有細菌的平板培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱，在溫度28°c的條件下培養(yǎng)，直至長出形態(tài)清晰的單個菌落；
(2)菌落標記:選擇菌落密度合適的平板培養(yǎng)基，根據(jù)菌落形態(tài)標記出目標菌落；
(3)染色:在長出菌落的平板培養(yǎng)基上，用濃度為2?5mg/mL的剛果紅溶液浸泡平板培養(yǎng)基，浸泡0.5?I分鐘后去掉剛果紅溶液；
(4)沖洗和浸泡:加入濃度為I mol/L的氯化鈉溶液沖洗平板培養(yǎng)基I?3次，再用濃度為I mol/L的氯化鈉溶液浸泡平板培養(yǎng)基3?5分鐘，然后倒掉氯化鈉溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)淡黃色的透明圈。
第二種剛果紅染色法，其步驟是:
(1)點種細菌:在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基上點種細菌，將點種細菌的平板培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱，在溫度28 °C的條件下培養(yǎng)，直至長出單個菌落。
(2)染色:在長出菌落的平板培養(yǎng)基上，用濃度為2?5mg/mL的剛果紅溶液浸泡平板培養(yǎng)基，浸泡0.5?1分鐘后去掉剛果紅溶液；
(3)沖洗和浸泡:加入濃度為I mol/L的氯化鈉溶液沖洗平板培養(yǎng)基1?3次，再用濃度為I mol/L的氯化鈉溶液浸泡平板培養(yǎng)基3?5分鐘，然后倒掉氯化鈉溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)淡黃色的透明圈。
上述羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基的配置方法是:
(1)稱取羧甲基纖維素鈉2克，酵母粉5克，瓊脂18克；
(2)溶解:用陳海水1000毫升將步驟(I)稱取的物質(zhì)溶解得到羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液；
(3)滅菌:將羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液用高壓滅菌鍋在高溫高壓環(huán)境下滅菌；
(4)傾倒平板培養(yǎng)基:將滅菌后的羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液傾倒平板培養(yǎng)基。
上述濃度為2?5mg/mL的剛果紅溶液為質(zhì)量體積比，即在100毫升的水里面加0.2?0.5克的剛果紅。
本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明將剛果紅的濃度至少提高到2 mg/mL，同時增加氯化鈉溶液沖洗的步驟(沖洗I?3次)，使染色時間從現(xiàn)有技術(shù)需要的十幾分鐘，甚至幾十分鐘，縮短到本發(fā)明染色時間0.5?I分鐘，大幅度縮短染色時間；氯化鈉溶液沖洗步驟的增加使浸泡脫色的時間從現(xiàn)有技術(shù)需要幾十分鐘縮短到約5分鐘，大幅度縮短浸泡的時間，而且透明圈清晰。本發(fā)明染色和浸泡時間的縮短減少了菌落的彌散，降低了交叉污染的可能性。也就是說染色和浸泡時間的縮短，使得菌落在液體里浸泡的時間縮短，菌落的彌散被控制在最小程度，降低了交叉污染的可能性(不同菌落之間混合在一起)。另外，本發(fā)明菌落不會發(fā)生彌散，也就不必有轉(zhuǎn)移的步驟，可以直接進行分離純化，程序簡化。
染色方法
為涂布接種培養(yǎng)的剛果紅染色法，其步驟是:
(I)涂布接種細菌:在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基(纖維素酶篩選培養(yǎng)基)上涂布接種產(chǎn)生纖維素酶的細菌，如芽孢桿菌、白色瘤胃球菌、熱纖梭菌，將涂布有細菌的羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱，在溫度28°C的條件下培養(yǎng)，約5天長出形態(tài)清晰的單個菌落。
羧甲基纖維素鈉瓊脂平板培養(yǎng)基具體制作步驟:步，稱量:稱取羧甲基纖維素鈉2克，酵母浸粉5克，瓊脂18克；第二步，溶解:用陳海水1000毫升將上述物質(zhì)一起溶解得到羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液。第三步，將羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液用高壓滅菌鍋在高溫高壓環(huán)境下滅菌，本實施例高溫高壓環(huán)境為:壓力103.4kPa(l.05kg/cm2)，溫度121.3° C，維持15?20分鐘。第四步，將滅菌后的羧甲基纖維素鈉瓊脂溶液傾倒平板，即:將裝有滅菌培養(yǎng)基的三角燒瓶傾斜，往培養(yǎng)皿中倒入15?20ml培養(yǎng)基，然后置于平面上冷卻，即得到所需平板培養(yǎng)基。
本發(fā)明陳海水是指不被陸上污物污染或很少混有淡水的海域取來的海水裝入玻璃瓶，并儲放在暗處數(shù)星期后(7天及以上)形成的海水。陳海水可以去除一些雜質(zhì)及懸浮顆粒。
涂布接種培養(yǎng)是用涂布棒在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板上涂布所接種的細菌，篩選出目的細菌，需要篩選海水里能夠產(chǎn)生纖維素酶的活性菌株，就取海水，稀釋到每個直徑為9cm的平板上有30?300個菌落生長。本實施例是用滅菌海水稀釋，然后在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板上涂布稀釋后的海水。本實施例滅菌海水為直接取陳海水進行高壓滅菌(壓力103.4kPa，溫度121.3。C，維持15?20分鐘)即可。
(2)標記菌落:選擇菌落密度合適的平板，一般選擇在直徑9cm的平板上有20?30個菌落，或更少，這樣可以縮小篩選范圍，然后根據(jù)菌落形態(tài)標記出目標菌落，特征明顯不同的菌落都需要標記，例如，不同顏色的菌落，表面是否光滑的菌落等等。而那些看上去分辨不出來的菌落則不用標記，例如，兩個菌落從形態(tài)，顏色，大小，表面特征均一樣，則認為兩個菌落是一種細菌，只標記一個菌落。標記是用記號筆將目標菌落圈起來。
(3)染色:在長出菌落的平板培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉瓊脂平板)上，浸泡濃度為0.2%?0.5%的剛果紅溶液，浸泡0.5?I分鐘后，倒去剛果紅溶液(即將培養(yǎng)皿傾斜，即可將剛果紅溶液倒掉)；這里濃度為0.2%?0.5%的剛果紅溶液是重量體積比，即10mL蒸餾水里面加0.2g?0.5g剛果紅，折算后濃度為2mg/mL?5mg/mL。本實施例采用濃度為0.2%(2mg/mL)的剛果紅溶液，浸泡時間為半分鐘(30秒)。浸泡是將菌落全部浸泡。
(4)沖洗和浸泡:加入濃度為1mol/L的氯化鈉溶液沖洗1?3次:本實施例沖洗是用裝有氯化鈉溶液的瓶子直接倒入可以覆蓋整個平板培養(yǎng)基的氯化鈉溶液，再將平板培養(yǎng)基傾斜，將溶液倒出去，再重復I?2次即可，然后再用濃度為I mol/L的氯化鈉溶液覆蓋浸泡3?5分鐘，然后倒掉氯化鈉溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)淡黃色的透明圈。
本實施例加入濃度為1mol/L的氯化鈉溶液沖洗2次，再覆蓋氯化鈉溶液浸泡4分鐘，然后倒掉氯化鈉溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)淡黃色的透明圈。
本實施例濃度為1mol/L的氯化鈉溶液配制方法:步，計算:氯化鈉(NaCl)物質(zhì)的量=1mol/LX IL=1mol,由氯化鈉摩爾質(zhì)量58.5g/mol,則氯化鈉質(zhì)量=1mol X 58.5g/mol=58.5g。第二步，稱量:用分析天平稱量58.5g。第三步，溶解:在燒杯中用50ml蒸餾水使稱取的氯化鈉完全溶解，并用玻璃棒攪拌。第四步，轉(zhuǎn)移:把溶解好的溶液移入10ml容量瓶。第五步，定容:加蒸餾水到接近刻度2?3厘米時，改用膠頭滴管加蒸餾水到刻度。第六步，搖勻:定容后的溶液濃度不均勻，要把容量瓶用瓶塞塞緊，用食指頂住瓶塞，用另一只手的手指托住瓶底，把容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動多次，使溶液混合均勻，即把定容后的氯化鈉溶液搖勻。把配制好的溶液倒入試劑瓶中，蓋上瓶塞，貼上標簽備用。