背景[1-3]
BCA蛋白定量試劑盒是一種雙組分、高精度、兼容去垢劑的蛋白定量試劑，可準(zhǔn)確測定蛋白濃度。對于蛋白研究中的常見樣品類型，Pierce BCA試劑均可準(zhǔn)確測定蛋白濃度。Pierce BCA試劑可用于評估全細(xì)胞裂解物、親和柱分離組分和蛋白樣品純化的產(chǎn)量，還可在工業(yè)應(yīng)用中用于蛋白污染的監(jiān)測。與大多數(shù)染料結(jié)合法相比，BCA蛋白定量法受蛋白質(zhì)氨基酸組成差異的影響更小，因此有更高的蛋白間定量一致性。
BCA蛋白定量試劑盒
BCA蛋白定量試劑盒測定工作原理
BCA蛋白測定法是在堿性環(huán)境下，通過蛋白將Cu2+還原為Cu1+，再通過二辛可寧酸(BCA)來檢測亞銅陽離子(Cu1+)。步是銅與堿性環(huán)境中的蛋白質(zhì)螯合，形成淺藍(lán)色復(fù)合物，這一過程被稱為雙縮脲反應(yīng)。在該反應(yīng)（雙縮脲反應(yīng)）中，由三個或更多氨基酸殘基的肽在含酒石酸鈉鉀的堿性環(huán)境中與銅離子形成有色螯合復(fù)合物。
在顯色反應(yīng)的第二步中，BCA與步形成的還原型（亞銅）陽離子發(fā)生反應(yīng)。兩分子BCA與一個亞銅離子螯合，產(chǎn)生深紫色反應(yīng)產(chǎn)物。BCA/銅復(fù)合物是水溶性的，在562 nm處具有強(qiáng)線性吸收，且吸收度隨蛋白質(zhì)濃度增加而升高。該復(fù)合物的靈敏度（檢測下限）大約是個反應(yīng)中淡藍(lán)色的100倍。
反應(yīng)很大程度上受到蛋白氨基酸序列中四個氨基酸殘基（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的影響。然而，不同于考馬斯染料結(jié)合法，肽鏈也有助于顏色形成，因此可將不同蛋白間的測量差異降至最低。
BCA蛋白定量試劑盒的特點(diǎn)包括：
?比色法測量—可以目測評估，也可使用標(biāo)準(zhǔn)分光光度計或酶標(biāo)儀(562 nm)進(jìn)行測量
?高度一致性—與染料結(jié)合法(Bradford)相比，BCA定量法的蛋白間差異更小
?兼容性強(qiáng)—在大多數(shù)離子型和非離子型去污劑的常見濃度下，性能不受影響
?定量時間—30分鐘孵育；與傳統(tǒng)Lowry法相比，操作更簡單，且檢測速度快4倍
?檢測范圍—BSA的線性工作范圍為20至2000μg/mL
?高靈敏度—使用增強(qiáng)方案，可檢測濃度低至5μg/mL的樣品
應(yīng)用[4][5]
BCA蛋白定量試劑盒可以用于溶葡萄球菌酶在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)與定向進(jìn)化
以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為表達(dá)宿主,實(shí)現(xiàn)了溶葡萄球菌酶的異源表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性突出;進(jìn)而通過隨機(jī)突變和定向進(jìn)化的方法,獲得了活性、產(chǎn)量更優(yōu)良的溶葡萄球菌酶。
主要研究進(jìn)展如下:(1)大腸桿菌與枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建。首先將溶葡萄球菌酶編碼基因lss片段與表達(dá)載體p ET28a、p GJ103和p HT43通過Gibson Assembly連接,成功構(gòu)建p ET28a-lss、p GJ103-lss和p HT43-lss。三種溶葡萄球菌酶重組表達(dá)質(zhì)粒,分別在表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)(p ET28a-lss)與枯草芽孢桿菌WB800N(p GJ103-lss、p HT43-lss)中實(shí)現(xiàn)了溶葡萄球菌酶的可溶性表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物對BL21(DE3)和WB800N無明顯抑制作用。溶葡萄球菌酶在BL21(DE3)中的表達(dá)量比在枯草芽孢桿菌WB800N中高,約為枯草芽孢桿菌表達(dá)量的10倍,但從WB800N中的純化方式更為簡單。
(2)溶葡萄球菌酶的效價評估。利用BCA法與Western Blot對BL21(DE3)/p ET28a-lss表達(dá)體系的溶葡萄球菌酶表達(dá)量進(jìn)行定性定量測定,發(fā)現(xiàn)該酶產(chǎn)量為4 mg/m L;接著通過最小抑菌濃度測定、牛津杯抑菌試驗(yàn)、最適溫度測定等方法對該酶進(jìn)行活性測定,結(jié)果表明,通過瓊脂稀釋法與微量肉湯稀釋法得到的最小抑菌濃度結(jié)果差異較大,瓊脂稀釋法得到的值約為微量肉湯稀釋法的4-16倍;當(dāng)溶葡萄球菌酶濃度僅為4μg/m L時,即可抑制所有金黃色葡萄球菌的生長,而其對溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的殺滅能力顯著低于對金黃色葡萄球菌殺滅能力的16-32倍,二者可能是由于不同菌類細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致。在牛津杯抑菌試驗(yàn)中,濃度為100μg/m L的溶葡萄球菌酶對20株金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小約為2.73 mm,而同等濃度苯唑西林產(chǎn)生的抑菌圈難以辨認(rèn)。最后,溶葡萄球菌酶的最適溫度為40℃。
(3)隨機(jī)突變。通過易錯PCR擴(kuò)增lss片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物與p ET28a通過Gibson Assembly連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得溶葡萄球菌酶突變庫。通過評價誘導(dǎo)時間與單克隆大小對蛋白表達(dá)量的影響,成功優(yōu)化基于96孔板的溶葡萄球菌酶高通量篩選方法。挑取大小相似的突變單克隆,高通量篩選獲得6個表現(xiàn)良好的突變體,分別為Mut-A96、Mut-A77、Mut-A92、Mut-A46、Mut-A95、Mut-A87,其中Mut-A77(H35W、V149A、S189G)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌BA01611的殺菌能力比野生型更強(qiáng)。因此,利用定點(diǎn)突變的方式依次構(gòu)建并表達(dá)了3個突變蛋白(Lyso(H35W)、Lyso(V149A)、Lyso(S189G)),最終發(fā)現(xiàn)只有3個突變位點(diǎn)同時存在時,才能夠提高溶葡萄球菌酶對金葡菌的抑菌能力;同時Mut-A77及其3個點(diǎn)突變蛋白的表達(dá)量升高,約為野生型表達(dá)量的2-4倍。
綜上所述,本研究成功實(shí)現(xiàn)了溶葡萄球菌酶在大腸桿菌BL21(DE3)與枯草芽孢桿菌WB800N中的異源表達(dá),得到最高表達(dá)量為4 mg/m L的溶葡萄球菌酶。抑菌效價測定發(fā)現(xiàn),溶葡萄球菌酶的專一性極強(qiáng),當(dāng)其濃度為4μg/m L時,即可抑制所有金黃色葡萄球菌的生長,分別是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的1/16和1/32。隨機(jī)突變和定向進(jìn)化試驗(yàn)得到了一個針對金黃色葡萄球菌抑菌效果更為突出的突變體Mut-A77(H35W、V149A、S189G),并發(fā)現(xiàn)Mut-A77及其3個點(diǎn)突變蛋白的表達(dá)量均高于野生型。
參考文獻(xiàn)
[1]Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by l-arabinose only[J].Stargardt Patrick;Striedner Gerald;Mairhofer Juergen.Microbial Cell Factories,2021(1)
[2]Therapeutic applications of lysostaphin against Staphylococcus aureus.[J].Jayakumar Jayalakshmi;Anil Kumar V;Biswas Lalitha;Biswas Raja.Journal of applied microbiology,2020(3)
[3]Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli.[J].Stargardt Patrick;;Feuchtenhofer Lukas;;Cserjan-Puschmann Monika;;Striedner Gerald;;Mairhofer Juergen.ACS synthetic biology,2020(6)
[4]The global prevalence of Daptomycin,Tigecycline,Quinupristin/Dalfopristin,and Linezolid-resistant Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci strains:a systematic review and meta-analysis.[J].Shariati Aref;;Dadashi Masoud;;Chegini Zahra;;van Belkum Alex;;Mirzaii Mehdi;;Khoramrooz Seyed Sajjad;;Darban-Sarokhalil Davood.Antimicrobial resistance and infection control,2020(1)
[5]孫彥婷.溶葡萄球菌酶在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)與定向進(jìn)化[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2022.