背景^[1-3]

人子宮頸癌由N.Auersperg從一位66歲白人子宮癌患者的子宮頸中分離出來，是此次患者宮頸癌活組織檢查中獲得的一系列細胞系之一。細胞最初表現(xiàn)出亞二倍體核型及上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代可導致核型不穩(wěn)定。

細胞內存在成視網膜細胞瘤蛋白(pRB)，但大小不正常；P53表達上調，第273位密碼子突變，從而導致Arg氨基酸替換為Cys，經檢測發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（HPV）DNA及RNA陰性。

人子宮頸癌

人子宮頸癌細胞培養(yǎng)步驟：

1）復蘇人子宮頸癌細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）人子宮頸癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1、對于貼壁人子宮頸癌細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

2、對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）人子宮頸癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

應用^[4][5]

人子宮頸癌細胞可以用于人子宮頸癌PD-L1的表達及其與腫瘤內浸潤T細胞的相關性研究

采用免疫組織化學染色觀察人體5例正常宮頸組織、7例高級別宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasiaⅡ-Ⅲ,CINⅡ-Ⅲ)組織和67例子宮頸癌組織PD-L1的表達和淋巴細胞PD-1的表達,免疫熒光染色觀察了相應組織內浸潤的CD4+T和CD8+T細胞數(shù)量,并通過TUNEL法檢測了腫瘤內浸潤淋巴細胞的凋亡情況。

研究結果顯示正常子宮頸上皮不表達PD-L1;宮頸瘤變上皮不表達或弱陽性表達PD-L1,其相對積分光密度平均值為(0.82±0.75);70%(47/67)的宮頸癌表達PD-L1,淺表浸潤(浸潤深度<5mm)和深部浸潤的宮頸鱗狀細胞癌PD-L1的相對積分光密度平均值分別為(2.70±1.68)、(2.90±1.72)。CIN病灶和腫瘤內浸潤的部分淋巴細胞表達PD-1。

子宮頸瘤變上皮與子宮頸鱗狀細胞癌PD-L1表達存在明顯差異(P<0.01),淺表浸潤的子宮頸鱗狀細胞癌PD-L1的表達略低于深部浸潤的鱗狀細胞癌,但無統(tǒng)計學差異;PD-L1陽性病例腫瘤局部浸潤的CD8+T細胞數(shù)量顯著減少,且PD-L1表達與CD8+T細胞數(shù)量明顯負相關(r=-0.82,P<0.01),但與腫瘤局部CD4+T細胞數(shù)量無明顯相關性(r=-0.05,P>0.05);雖然原發(fā)灶內宮頸癌細胞表達PD-L1,但淋巴結轉移灶內的宮頸癌細胞不表達PD-L1;部分PD-L1陽性的子宮頸癌局部浸潤的淋巴細胞存在凋亡現(xiàn)象。

本研究結論:子宮頸癌細胞異常表達PD-L1,且PD-L1的表達與腫瘤局部浸潤的CD8+T細胞數(shù)量減少有關,但與浸潤的CD4+T細胞數(shù)量無關。癌細胞PD-L1的表達與其淋巴結轉移無關。癌細胞可能通過PD-L1/PD-1途徑促進了腫瘤內浸潤的T淋巴細胞凋亡。

參考文獻

[1]Immunohistochemical localization of programmed death-1 ligand-1(PD-L1)in gastric carcinoma and its clinical significance[J].Changping Wu;;Yibei Zhu;;Jingting Jiang;;Jiemin Zhao;;Xue-Guang Zhang;;Ning Xu.Acta Histochemica,2006(1)

[2]The B7-H1(PD-L1)T Lymphocyte-Inhibitory Molecule Is Expressed in Breast Cancer Patients with Infiltrating Ductal Carcinoma:Correlation with Important High-Risk Prognostic Factors[J].Hazem Ghebeh;;Shamayel Mohammed;;Abeer Al-Omair;;Amal Qattant;;Cynthia Lehe;;Ghofran Al-Qudaihi;;Naser Elkum;;Mohamed Alshabanah;;Suad Bin Amer;;Asma Tulbah;;Dahish Ajarim;;Taher Al-Tweigeri;;Said Dermime.Neoplasia,2006(3)

[3]Immunological Microenvironments in the Human Vagina and Cervix:Mediators of Cellular Immunity Are Concentrated in the Cervical Transformation Zone1[J].Jeffrey Pudney;;Alison J.Quayle;;Deborah J.Anderson.Biology of Reproduction,2005(6)

[4]Interaction of PD-L1 on tumor cells with PD-1 on tumor-specific T cells as a mechanism of immune evasion:implications for tumor immunotherapy[J].Christian Blank;;Thomas F.Gajewski;;Andreas Mackensen.Cancer Immunology,Immunotherapy,2005(4)

[5]王渝琦.人子宮頸癌PD-L1的表達及其與腫瘤內浸潤T細胞的相關性研究[D].重慶醫(yī)科大學,2010.