背景^[1-3]

LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系建立于1979年，從一名60歲的右額葉頂葉-枕葉膠質(zhì)母細(xì)胞瘤女性白人患者中獲得。LN229細(xì)胞系有一個野生型PTEN基因、突變的p53基因，可能在p16和p14ARF腫瘤抑制基因中存在純合子缺失。常用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等機(jī)制研究。

LN229為貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞樣，可在裸鼠中形成腫瘤，該細(xì)胞STR鑒定結(jié)果無誤，且支原體檢測陰性。

LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系

LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)步驟

一、復(fù)蘇LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

二、LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a）、對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

b）、對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。

三、LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：

1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3、用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4、先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃

應(yīng)用^[4][5]

LN-229人腦髓母細(xì)胞瘤貼壁細(xì)胞系可以用于PEITC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制的研究

探索苯乙基異硫氰酸酯對人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229的生長影響極其影響機(jī)制,為將苯乙基異硫氰酸酯應(yīng)用到預(yù)防和治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。

方法：本研究的研究對象是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞,利用MTT試驗檢測PEITC對腫瘤細(xì)胞的生長和增殖的影響。MTT是一種黃色染料。在細(xì)胞線粒體內(nèi)含有的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的共同作用下,MTT被代謝還原為藍(lán)紫色且不溶于水的甲臜,通過測定490 nin處甲躦的含量就可推測活細(xì)胞的數(shù)量。

通過Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。Annexin-V是一種依賴于Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白,當(dāng)在Ca2+存在條件下,Annexin-V可以與細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合,使磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞膜外標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的開始；PI是一種DNA染料,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡晚期后,細(xì)胞膜的通透性會發(fā)生變化,此時PI進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合,因此,通過Annexin-V/PI雙染色法就可以檢測到細(xì)胞凋亡,分析細(xì)胞內(nèi)的DNA含量的不同研究細(xì)胞周期的變化。

利用DCFH-DA探針法檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的表達(dá)水平。DCFH-DA探針是用于特異的鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS含量,其可以穿過細(xì)胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH,而細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無熒光標(biāo)記的DCFH轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒鈽?biāo)記的DCF。所以,通過檢測細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度就可以鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化。

同時通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELI SA)檢測用PEITC處理后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。采用western blot法檢測含半胱氨酸的天冬氨酸酪蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)活性的變化。結(jié)果：當(dāng)PEITC作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞72小時后,細(xì)胞的生長受到顯著抑制,且這種抑制作用具有PEITC濃度依賴性(IC50=20uM)。

結(jié)果還顯示,當(dāng)濃度分別為10μM和20μM的PEITC時,PEITC對細(xì)胞生長的抑制率較高,而且對正常細(xì)胞表現(xiàn)出無毒或弱毒性。因此,在接下來的研究中本文選擇的PEITC濃度分別為10μM和20μM。流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示：分別用10μM和20μM的PEITC處理LN229細(xì)胞24小時后,對照組的細(xì)胞凋亡率僅為5%；10 gM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率為30.3%(P<0.05)；而20μM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率高達(dá)64.9%(P<0.05)。同時,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果還顯示處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯上升,而G0/G1期的細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)。

對ROS表達(dá)水平的檢測結(jié)果顯示101μMPEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對照組高4倍,而20μM PEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對照組高6倍,且統(tǒng)計分析具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

此外,用10μM和20μM的PEITC分別處理LN229細(xì)胞24小時后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD的表達(dá)水平明顯降低。10μM PEITC組20μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的GSH表達(dá)量與對照組細(xì)胞GSH表達(dá)量相比僅為69.3%和42.4%(P<0.05)；而10μM PEITC組和20μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的SOD表達(dá)量與對照組細(xì)胞SOD表達(dá)量相比僅為60.7%和20.6%(P<0.05)；而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性與對照組(β-actin)相比顯著增加(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

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