背景^[1-3]

AML12小鼠正常肝細(xì)胞，是從攜帶人TGF-α基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（CD1株，MT42系）的肝細(xì)胞中構(gòu)建的，屬于原代永生化細(xì)胞，可用于研究肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

AML12，貼壁生長，上皮細(xì)胞樣，呈多角形，直徑約為20-30um，電鏡下表現(xiàn)出典型的肝細(xì)胞特征，如過氧化物酶體和膽管狀結(jié)構(gòu)。AML12(小鼠肝12)細(xì)胞系是從攜帶人TGF-alpha基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(CD1株，MT42系)的肝細(xì)胞中構(gòu)建的。AML12細(xì)胞保留了表達(dá)血清(白蛋白、α-1抗胰蛋白酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白)和縫隙連接(連接蛋白26和32)的高水平mRNA的能力，并且只包含乳酸脫氫酶的同工酶5。

AML12

AML12小鼠正常肝細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇AML12細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）AML12細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、對于AML12細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗AML12細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打AML12細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將AML12細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

AML12可以用于草甘膦對小鼠肝臟生物鐘和糖脂代謝的影響

從生物鐘的角度出發(fā),通過在小鼠AML12肝細(xì)胞和ICR品系野生型雄性小鼠上建立草甘膦暴露模型,利用實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)、蛋白免疫印跡(Western blotting,WB)、過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff,PAS)染色、試劑盒定量檢測等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù),對草甘膦影響小鼠肝臟糖脂代謝的作用機(jī)制進(jìn)行了探究,研究結(jié)果如下:

1. 通過CCK-8試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)篩選出對AML12細(xì)胞的活力和凋亡都沒有顯著影響的草甘膦處理濃度(0.1 m M),并用此濃度對毛喉素同步化后的AML12細(xì)胞進(jìn)行處理,使用q PCR和WB技術(shù)檢測草甘膦對AML12細(xì)胞生物鐘基因和糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量與表達(dá)節(jié)律性的影響。結(jié)果表明,對照組和草甘膦處理組AML12細(xì)胞生物鐘基因(Bmal1、Nr1d1與Dbp)m RNA的表達(dá)均具有節(jié)律性變化。0.1 m M的草甘膦顯著抑制了AML12細(xì)胞生物鐘基因(Bmal1、Nr1d1和Dbp)m RNA的表達(dá),并降低了NR1D1蛋白的表達(dá)量。同時,0.1 m M的草甘膦顯著抑制了Fasn、Pparα、Hmgcr與Glut2等糖脂代謝相關(guān)基因m RNA在AML12細(xì)胞的表達(dá)。

2. 為了探究草甘膦對小鼠生物鐘系統(tǒng)與糖脂代謝的影響,通過查閱文獻(xiàn),最終確定以小鼠自由飲用0.5%草甘膦水溶液8周的方式進(jìn)行造模,對照組小鼠自由飲用不含草甘膦的蒸餾水。造模期間,準(zhǔn)確監(jiān)測小鼠的行為活動節(jié)律、體重、采食量和飲水量。造模成功后,收集小鼠血液與肝臟組織樣品,通過糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐量試驗(yàn)、PAS染色、q PCR、WB以及試劑盒等多種技術(shù)檢測草甘膦對小鼠肝臟生物鐘系統(tǒng)與糖脂代謝的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,草甘膦處理組小鼠造模期間在光照條件下的活動量顯著升高,采食量沒有顯著性差異,但飲水量顯著下降;體重增長雖然與對照組相比差異不顯著,但呈下降趨勢。糖耐量試驗(yàn)結(jié)果表明,草甘膦處理組小鼠對葡萄糖的吸收和代謝速度顯著低于對照組小鼠。

3. 胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果表明,草甘膦處理組小鼠胰島素敏感性和升血糖能力顯著低于對照組小鼠。PAS染色和試劑盒定性定量檢測結(jié)果表明,草甘膦處理組小鼠肝糖原含量顯著低于對照組小鼠。膽固醇檢測試劑盒定量檢測結(jié)果說明,草甘膦處理組小鼠肝臟膽固醇含量顯著低于對照組小鼠。q PCR和WB結(jié)果說明,對照組和草甘膦處理組小鼠肝臟生物鐘基因(Bmal1、Nr1d1和Dbp)m RNA的表達(dá)均具有節(jié)律性,與對照組相比,草甘膦處理組小鼠生物鐘基因m RNA的表達(dá)相位均發(fā)生了不同程度的延遲,但生物鐘基因m RNA總體表達(dá)量無顯著性差異。

此外,草甘膦處理組小鼠肝臟BAML1蛋白相較于對照組有下降趨勢,但差異不顯著,NR1D1蛋白總體表達(dá)量與對照組相比無顯著性差異。與對照組相比,草甘膦處理組小鼠肝臟糖代謝相關(guān)基因(Glut2、Cd36與Pdk4)m RNA的總體表達(dá)量顯著下降,同時肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因(Srebp-1c與Fasn)m RNA的表達(dá)量在ZT20(授時時間,Zeitgeber Time,ZT)時間點(diǎn)顯著高于對照組,Pparγ基因m RNA表達(dá)量在ZT4時間點(diǎn)顯著低于對照組,脂質(zhì)分解相關(guān)基因Pparα的m RNA表達(dá)量在ZT20時間點(diǎn)顯著高于對照組。

上述研究證據(jù)表明,草甘膦暴露抑制了AML12細(xì)胞部分生物鐘基因和糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),擾亂了小鼠的活動節(jié)律,使小鼠肝臟生物鐘基因m RNA表達(dá)相位延遲,降低了小鼠肝臟糖原與膽固醇的累積,造成小鼠糖脂代謝紊亂。然而,本研究仍存在一定的局限性,當(dāng)前的結(jié)果無法證明肝臟生物鐘系統(tǒng)參與了草甘膦對肝臟糖脂代謝功能的影響,并且尚缺乏對草甘膦影響肝臟糖脂代謝作用機(jī)制的深入解析。

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