背景[1-3]
HEP-G2細胞系人肝癌細胞來源于一名15歲的白人少年的肝癌組織。該細胞表達甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、結(jié)合珠蛋白、銅藍蛋白、纖溶酶原、補體C4、C3激活物、纖維蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白；表達胰島素受體和胰島素樣生長因子IGFⅡ的受體；該細胞具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未證明該細胞中有HBV基因組。
HEP-G2細胞系
HEP-G2細胞系人肝癌細胞培養(yǎng)步驟
一、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1、準備MEM培養(yǎng)基；北美胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2、HEP-G2細胞系人肝癌細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3、HEP-G2細胞系人肝癌細胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二、HEP-G2細胞系人肝癌細胞細胞處理：
1、復(fù)蘇HEP-G2細胞系人肝癌細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2、HEP-G2細胞系人肝癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、收到細胞后傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:5的比例進行。
HEP-G2細胞系人肝癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
HEP-G2細胞系人肝癌細胞可以用于苦參堿通過mTOR信號通路誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象
探討苦參堿(Matrine,Mat)誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象的分子機制。
方法：以人肝癌Hep G2細胞為研究對象,不同濃度苦參堿(0,0.25,0.5,1.0,2.0mg/ml)干預(yù)12h,24h,48h后,用倒置顯微鏡觀察Hep G2細胞的形態(tài)學(xué)變化,透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化,實時定量RT-PCR檢測Beclin 1 mRNA的表達水平,Western blotting方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ,雷帕霉素靶蛋白(mTOR/p-mTOR)及其下游的核糖體蛋白質(zhì)S6(p70s6k/p-p70s6k)蛋白的表達。
結(jié)果：0,0.25,0.5,1.0,2.0 mg/ml苦參堿作用12h,24h,48h后,以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)對照組(0 mg/ml苦參堿)細胞生長良好,形態(tài)正常,貼壁完整,苦參堿組細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)了大小不等的空泡,并不斷增多、變大。1.0和2.0mg/ml的苦參堿作用12,24,48h后,培養(yǎng)基中出現(xiàn)不能貼壁的懸浮細胞,細胞變小、變圓。2.0 mg/ml的苦參堿作用48h后,整個培養(yǎng)基在鏡下呈一片荒涼狀。透射電子顯微鏡下進一步證實1.0mg/ml苦參堿干預(yù)24h后,與對照組(0mg/ml苦參堿)相比,苦參堿處理組細胞可見腫脹的細胞器,雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的細胞質(zhì),以及明顯的自噬小泡和空泡。
實時定量RT-PCR和Western blotting檢測顯示苦參堿作用人肝癌Hep G2細胞后,以時間和劑量依賴方式上調(diào)自噬現(xiàn)象發(fā)生過程中必不可少的基因Beclin 1的mRNA及自噬現(xiàn)象發(fā)生的分子標志LC3-Ⅱ蛋白的表達。
Western blotting檢測同時顯示苦參堿誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細胞發(fā)生的自噬現(xiàn)象可能是通過mTOR信號通路實現(xiàn)?？鄥A干預(yù)24h后,mTOR及其下游p-70s6k蛋白的表達沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)；0,0.25,1.0,2.0mg/ml的苦參堿作用24h后,p-mTOR及p-p70s6k蛋白的表達量隨著苦參堿濃度的增加而下調(diào)。
結(jié)論：苦參堿能夠以時間和劑量依賴性的方式誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象,并且這種自噬現(xiàn)象的誘導(dǎo)可能通過下調(diào)mTOR信號通路實現(xiàn)。
參考文獻
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