背景[1-3]
RT4細胞來源于一名63歲的白人男性移行細胞乳頭狀瘤患者的膀胱組織，細胞顯示上皮形態(tài)，常用于免疫腫瘤學研究中，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
RT4細胞
RT4細胞培養(yǎng)操作
1) 復蘇RT4細胞：
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)RT4細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)RT4細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應用[4][5]
RT4可以用于miR-490家族對膀胱癌EJ和RT4細胞生物學行為的影響及機制探討
以miRNA-490家族為著眼點,旨在研究闡明其在膀胱癌發(fā)生進展中的作用及可能的通路,加深miRNA對膀胱癌發(fā)生及由非肌層浸潤性向肌層浸潤性進展機制的認識。這將有助于從分子水平上探索膀胱癌的治療新靶點,早期、全程的控制膀胱癌病程的進展。[目的]探討miR-490家族對膀胱癌細胞EJ和RT4生物學行為的影響及其對膀胱癌細胞發(fā)生發(fā)展的作用,并對其分子機制和信號通路進行深入的研究。
[方法]1.在膀胱癌細胞系EJ和RT4中應用qPCR檢測miR-490的基礎(chǔ)表達含量;
2. Transwell實驗和劃痕愈合實驗檢測miR-490家族對膀胱癌細胞侵襲和遷移能力的影響;
3. CCK8法檢測miR-490家族對膀胱癌細胞增殖能力變化的影響;
4. 運用生物信息學的方法預測miR-490家族可能的靶基因;
5. 應用qPCR檢測轉(zhuǎn)染后膀胱癌細胞中miR-490家族表達變化以及可能靶基因和相關(guān)基因的表達變化;
6. 應用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測miR-490家族對可能靶基因蛋白和相關(guān)蛋白表達的影響。
[結(jié)果]1.RT4細胞相較于EJ細胞miR-490的基礎(chǔ)表達水平較低;
2. Transwell實驗檢測細胞侵襲能力的結(jié)果為:在EJ和RT4細胞中miR-490-5p模擬物轉(zhuǎn)染組侵襲能力均高于對照組,在RT4細胞中miR-490-3p模擬物轉(zhuǎn)染組侵襲能力高于對照組,miR-490-3p抑制物轉(zhuǎn)染組侵襲能力低于對照組;劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力的結(jié)果為:在EJ細胞中miR-490-5p/3p模擬物組細胞劃痕面積低于對照組,miR-490-5p/3p抑制物組細胞劃痕面積高于對照組;在RT4細胞中miR-490-5p/3p抑制物組劃痕面積高于對照組;
3. CCK-8法檢測細胞增殖能力的結(jié)果為:在EJ和RT4細胞中miR-490-5p/3p模擬物組細胞增殖能力高于對照組,在EJ細胞中miR-490-5p/3p抑制物組細胞增殖能力低于對照組,在RT4細胞中miR-490-3p抑制物組細胞增殖能力低于對照組;
4. TargetScan 7.1數(shù)據(jù)庫和miRDB數(shù)據(jù)庫預測hnRNPA1是miR-490可能的靶基因之一;
5. qPCR檢測miR-490及相關(guān)基因表達變化結(jié)果:在EJ和RT4細胞中,miR-490-5p/3p模擬物組miR-490表達水平均高于對照組,miR-490-5p/3p抑制物組miR-490表達水平均低于對照組;在EJ細胞中,miR-490-5p/3p模擬物組hnRNPA1表達水平高于對照組,而在RT4細胞中,miR-490-5p/3p模擬物組hnRNPA1表達水平低于對照組,miR-490-5p抑制物組hnRNPA1表達水平高于對照組;在EJ和RT4細胞中,miR-490-5p/3p模擬物組Kras表達水平均高于對照組;
6.蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測相關(guān)蛋白表達情況結(jié)果為:在EJ和RT4細胞中,miR-490-5p/3p模擬物組Kras蛋白表達水平升高,miR-490-5p/3p抑制物組Kras蛋白表達水平降低;在EJ細胞中miR-490-5p/3p抑制物組N-cadherin表達升高,E-cadherin表達降低;在RT4細胞中miR-490-5p/3p模擬物組N-cadherin,E-cadherin表達降低。
參考文獻
[1]Pathologic Downstaging and Survival Outcomes Associated with Neoadjuvant Chemotherapy for Variant Histology Muscle Invasive Bladder Cancer..Chakiryan Nicholas H;Jiang Da David;Gillis Kyle A;Green Elizabeth;Hajiran Ali;Hugar Lee;Zemp Logan;Zhang Jingsong;Jain Rohit;Chahoud Jad;Poch Michael;Manley Brandon J;Li Roger;Sexton Wade;Gilbert Scott M.The Journal of urology,2021
[2]UroVysion fluorescence in situ hybridization in urothelial carcinoma:a narrative review and future perspectives..Nagai Takashi;Naiki Taku;Etani Toshiki;Iida Keitaro;Noda Yusuke;Shimizu Nobuhiko;Isobe Teruki;Nozaki Satoshi;Okamura Takehiko;Ando Ryosuke;Kawai Noriyasu;Yasui Takahiro.Translational andrology and urology,2021
[3]Cancer Statistics,2021.Siegel Rebecca L.;Miller Kimberly D.;Fuchs Hannah E.;Jemal Ahmedin.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021
[4]Current and emerging bladder cancer biomarkers with an emphasis on urine biomarkers..Lopez-Beltran Antonio;;Cheng Liang;;Gevaert Thomas;;Blanca Ana;;Cimadamore Alessia;;Santoni Matteo;;Massari Francesco;;Scarpelli Marina;;Raspollini Maria R;;Montironi Rodolfo.Expert review of molecular diagnostics,2020
[5]陳旅陽.miR-490家族對膀胱癌EJ和RT4細胞生物學行為的影響及機制探討[D].昆明醫(yī)科大學,2019.