背景^[1-3]

非洲綠猴腎細(xì)胞是由日本千葉大學(xué)的Y·Yasumura和Y·Kawakita從正常成年非洲綠猴的腎臟建株的。1964年6月15日，B·Simizu將Vero細(xì)胞從千葉大學(xué)帶到國(guó)立健康研究所(NIH)國(guó)立過敏及傳染病研究所熱帶病毒實(shí)驗(yàn)室時(shí)，已傳至第93代。

非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞）是非洲綠猴腎細(xì)胞，是一種異倍體細(xì)胞，經(jīng)獼猴腎細(xì)胞培養(yǎng)衍化后產(chǎn)生的，和著名的Hela細(xì)胞系、犬腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)一樣是常用的細(xì)胞系。

非洲綠猴腎細(xì)胞

非洲綠猴腎細(xì)胞培養(yǎng)體系：MEM+10%FBS

非洲綠猴腎細(xì)胞培養(yǎng)條件：

氣相:空氣,95%;CO2,5%;溫度:37℃

非洲綠猴腎細(xì)胞凍存條件：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8%DMSO+20%FBS，液氮保存

非洲綠猴腎細(xì)胞傳代步驟

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次；

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化；

按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻；

收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:4的比例進(jìn)行。

非洲綠猴腎細(xì)胞凍存步驟

細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；

4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x10(6)/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)；

將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

非洲綠猴腎細(xì)胞可以用于氧氟沙星和銅及其絡(luò)合體系對(duì)非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）的毒性效應(yīng)

抗生素的濫用使其通過多種途徑進(jìn)入環(huán)境,從而產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)。重金屬在土壤及水體環(huán)境中普遍存在,其隱蔽性強(qiáng)的特性導(dǎo)致它容易通過食物鏈富集,造成動(dòng)植物出現(xiàn)重金屬中毒。抗生素及重金屬在環(huán)境中的共存現(xiàn)象非常普遍,并且抗生素易與重金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),使它們的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估變得更加復(fù)雜。研究抗生素與重金屬對(duì)環(huán)境中生物的復(fù)合風(fēng)險(xiǎn)勢(shì)在必行。

研究選擇抗生素中的代表性物質(zhì)氧氟沙星(OFL)和重金屬中的銅離子(Cu2+)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)離體細(xì)胞培養(yǎng)中的模式細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)進(jìn)行復(fù)合污染物毒性實(shí)驗(yàn),以此研究抗生素OFL與Cu2+及其復(fù)合污染物對(duì)Vero細(xì)胞的生物效應(yīng)。通過對(duì)比OFL、Cu2+及其復(fù)合污染物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性效應(yīng)的差異研究復(fù)合污染與單獨(dú)污染的區(qū)別,并進(jìn)一步探討影響氧氟沙星和Cu2+絡(luò)合物形成的影響因素(pH值和溫度)及復(fù)合絡(luò)合體系對(duì)Vero細(xì)胞的毒性效應(yīng)。所以本研究對(duì)抗生素與重金屬?gòu)?fù)合污染的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)研究具有一定理論和實(shí)踐價(jià)值。

結(jié)果表明:(1)OFL與Cu2+及其復(fù)合污染物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞破碎,貼壁率降低。當(dāng)Cu2+濃度從6.88 mg·L-1增加到6875 mg·L-1時(shí),其對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率也上升了55%。實(shí)驗(yàn)表明,OFL對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)也有顯著的影響,當(dāng)OFL濃度低于3mg·L-1時(shí),OFL促進(jìn)了Vero細(xì)胞的生長(zhǎng);而當(dāng)OFL濃度高于3 mg·L-1時(shí),Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)則被抑制。

(2) 氧氟沙星和銅復(fù)合污染對(duì)Vero細(xì)胞的毒性與其污染物單獨(dú)污染時(shí)的毒性之和相比有所下降。在2.75 mg·L-1Cu2+濃度時(shí),OFL濃度從0.63 mg·L-1增加到10 mg·L-1時(shí)其復(fù)合污染物對(duì)細(xì)胞的抑制率從24%上升到了最高47%。當(dāng)OFL濃度為2.5 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-1時(shí),OFL與濃度為2.75 mg·L-1 Cu2+的復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的抑制率與OFL、Cu2+單一抑制率之和有顯著差異,呈現(xiàn)出抑制率下降的趨勢(shì)。同時(shí),當(dāng)Cu2+濃度6.88mg·L-1處理下時(shí)出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,OFL與濃度為6.88 mg·L-1 Cu2+的復(fù)合物對(duì)細(xì)胞抑制率顯著低于OFL、Cu2+單一抑制率之和。

(3) DMEM培養(yǎng)基中OFL與Cu2+的游離的量要顯著低于水環(huán)境中兩者游離的量。說明OFL和Cu2+會(huì)與DMEM培養(yǎng)基中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),形成一個(gè)由OFL與Cu2+為主的復(fù)合絡(luò)合體系。

(4) 溫度和pH值的變化能夠?qū)MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中的OFL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系總濃度產(chǎn)生顯著的影響。隨著溫度的升高,OFL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系總濃度逐漸增大,這說明溫度的升高不但增大了氧氟沙星和銅離子之間的相互作用,還提高了它們與DMEM培養(yǎng)液中其他物質(zhì)的反應(yīng)活性。同時(shí),pH值的增大也使得OFL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系的總濃度上升,這說明pH值的增大能夠提高氧氟沙星與銅的反應(yīng)活性及其絡(luò)合能力。

(5) OFL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系不會(huì)對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性效應(yīng)。OFL和Cu2+復(fù)合污染毒性與單獨(dú)污染毒性之和相比有所下降的主要原因之一是在氧氟沙星與銅復(fù)合污染體系中DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、OFL和Cu2+相互之間發(fā)生了反應(yīng),形成了OFL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系,而該體系對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響不顯著,從而降低了氧氟沙星和銅復(fù)合污染的總體毒性。

由此看來,抗生素OFL與重金屬Cu2+對(duì)Vero細(xì)胞的復(fù)合毒性會(huì)因?yàn)镺FL-Cu2+復(fù)合絡(luò)合體系的產(chǎn)生而下降。說明OFL與Cu2+對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)具有拮抗作用。表明環(huán)境中污染物間可能存在拮抗作用使復(fù)合污染對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)下降。

參考文獻(xiàn)

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