背景[1-3]
CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系是人軟骨肉瘤細(xì)胞系的一種。這個(gè)細(xì)胞系來(lái)源于軟骨肉瘤，具體是男性患者的病變組織。在培養(yǎng)過(guò)程中，這些細(xì)胞會(huì)貼壁生長(zhǎng)，并且形態(tài)為上皮細(xì)胞樣。
2.
CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系
CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系培養(yǎng)步驟：
1.復(fù)蘇CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2.CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
2.1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
2.3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
2.4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3.CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
應(yīng)用[4-5]
CAL-78人軟骨肉瘤細(xì)胞系可以用于雙調(diào)蛋白—E-鈣黏蛋白表達(dá)調(diào)控對(duì)人軟骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力影響的實(shí)驗(yàn)研究
探究雙調(diào)蛋白對(duì)軟骨肉瘤的影響及相關(guān)機(jī)制,也涉及探究軟骨肉瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程,有助于人類加深對(duì)軟骨肉瘤的認(rèn)知,也對(duì)今后軟骨肉瘤的診斷治療的進(jìn)步有著重要的意義。
方法:將一定濃度的雙調(diào)蛋白配入完全培養(yǎng)基中,并將軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353與CAL-78放入該培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取受到雙調(diào)蛋白影響的軟骨肉瘤細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)染雙調(diào)蛋白的Si RNA獲得內(nèi)源性雙調(diào)蛋白下調(diào)的細(xì)胞,同時(shí)使用MEK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞后獲得阻斷了相關(guān)通路的軟骨肉瘤細(xì)胞,并將這些細(xì)胞再次以雙調(diào)蛋白處理后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。采取Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)分別測(cè)量各組細(xì)胞的侵襲、增殖、遷移、黏附能力。利用Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)測(cè)得了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、SLUG等相關(guān)因子的蛋白和基因水平的變化。
結(jié)果:一、雙調(diào)蛋白作用于軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353及CAL-78后,兩種細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng),且E-鈣黏蛋白表達(dá)下降而N-鈣黏蛋白、SLUG的表達(dá)上升,MEK/ERK和PI3K/AKT通路的相關(guān)蛋白磷酸化水平上升。
二、轉(zhuǎn)染雙調(diào)蛋白Si RNA、MEK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002處理后的軟骨肉瘤細(xì)胞再次予以雙調(diào)蛋白處理后,以上表現(xiàn)則受到抑制。
三、本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雙調(diào)蛋白作用于軟骨肉瘤細(xì)胞后,其遷移、增殖及黏附能力也有所增強(qiáng),且Snail、Twist1等其他上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中重要的調(diào)控因子的基因表達(dá)也有所上升。本研究所有試驗(yàn)重復(fù)三次,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)p值均小于0.05,結(jié)果有顯著性差異。
結(jié)論:本研究表明,雙調(diào)蛋白通過(guò)下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)軟骨肉瘤細(xì)胞侵襲。MEK/ERK和PI3K/AKT通路與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程可能參與這一過(guò)程。同時(shí),雙調(diào)蛋白對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力也有增強(qiáng)的作用。
參考文獻(xiàn)
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