背景[1-3]
蛋白酶K溶液不含DNase，不含RNase，可直接用于消化各種蛋白以及常見的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，例如基因組DNA抽提、酶的消化去除等。
蛋白酶K溶液濃度為50-100μg/mL，需根據(jù)所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH是否適合、溫度是否適合等因素確定具體的工作濃度。常用濃度的EDTA、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl、鹽酸胍對(duì)蛋白酶K的活力影響不大。
酶活力:其含量30U/mg,在37℃以血紅蛋白為底物，1分鐘內(nèi)可以產(chǎn)生相當(dāng)于1μM酪氨酸Folin陽性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定義為一個(gè)單位蛋白酶K酶活力。有效的pH范圍為pH4.0～12.5，適合pH范圍為pH7.5～8.0。
蛋白酶K溶液
蛋白酶K的佳反應(yīng)溫度為65℃，大于65℃蛋白酶K會(huì)迅速地降解，一般采用反應(yīng)50～55℃。在0.2～1%SDS或約10mM尿素存在的情況下，蛋白酶K顯示更高的酶活性，常用工作濃度為0.05～1mg/ml。
蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，具有高效的酶活性和廣泛的底物特異性，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵，常被用于降解蛋白生產(chǎn)短肽。它具有絲氨酸蛋白酶類所特有的典型催化三聯(lián)體Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周圍有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)增加其穩(wěn)定性，使其在更廣泛的條件下保持較高的酶活力。
蛋白酶K在使用過程中的注意事項(xiàng)
（1）蛋白酶K的反應(yīng)溫度為65℃，但在65℃或更高的溫度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解，因此推薦反應(yīng)溫度50℃-55℃；
（2）Ca2+可以保護(hù)蛋白酶K不會(huì)自我降解、增加蛋白酶K的熱穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)蛋白酶K的底物結(jié)合位點(diǎn)；
（3）配制好的蛋白酶K溶液分裝保存于-20℃，避免反復(fù)凍融，以免酶活力下降；
應(yīng)用[4-5]
蛋白酶K溶液可以用于外源蛋白酶K對(duì)生長(zhǎng)后期草魚生產(chǎn)性能、腸道消化吸收能力和肌肉品質(zhì)的影響
研究了飼糧中添加蛋白酶K溶液對(duì)生長(zhǎng)后期草魚生產(chǎn)性能、腸道消化吸收能力和肌肉品質(zhì)的影響,并依據(jù)不同標(biāo)識(shí)確定了外源蛋白酶K在生長(zhǎng)后期草魚飼糧中的最適添加量。試驗(yàn)選取450尾健康草魚(619.51±0.54 g),隨機(jī)分為6組,3個(gè)重復(fù)/處理,25尾魚/重復(fù),分別飼喂外源蛋白酶K水平不同(0、3000、6000、9000、12000和15000 U/kg)的6種試驗(yàn)飼糧60天。
結(jié)果表明:飼糧中添加適宜水平外源蛋白酶K溶液能夠提高生長(zhǎng)后期草魚的生產(chǎn)性能、氨基酸代謝和消化吸收能力:
(1)提高了采食量、增重百分比、特定生長(zhǎng)率(P<0.05)、蛋白質(zhì)效率比(P<0.08);
(2)提高了肝胰臟和肌肉谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的活力(P<0.05),降低了血氨含量和肝胰臟谷氨酸脫氫酶的活力(P<0.05);
(3)提高了腸體指數(shù)、腸長(zhǎng)指數(shù)、腸道皺襞高度和寬度、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、Na+/K+-ATP酶、肌酸激酶、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力(P<0.05);提高了血清中IIe、Leu和Thr等14種游離氨基酸的含量,降低了腸道中16種游離氨基酸的含量(P<0.05)。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):飼糧中添加適宜水平外源蛋白酶K溶液能夠提高生長(zhǎng)后期草魚前、中、后腸SLC7A7、SLC7A6、SLC1A3、SLC1A5、SLC6A14、SLC6A19b、SLC7A1、SLC7A5、SLC7A8、SLC7A9、SLC38A2、SLC6A6、TOR和S6K1的m RNA水平(P<0.05),下調(diào)4EBP1的m RNA水平(P<0.05),上調(diào)SLC1A5、SLC7A6、SLC1A3、T-TOR以及p-TORSer2448的蛋白表達(dá)(P<0.05)。
此外,飼糧中添加適宜水平外源蛋白酶K可改善生長(zhǎng)后期草魚的肌肉品質(zhì):
(1) 提高了草魚肌肉的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)、白度(W)、p H24h值和肌肉中UFA、C:18和亞油酸等脂肪酸含量(P<0.05);
(2) 降低了草魚肌肉蒸煮損失、剪切力、乳酸和羥脯氨酸含量(P<0.05);
(3)增加了草魚肌肉粗蛋白、粗脂肪和Val、IIe和Arg等12種游離氨基酸的含量(P<0.05)、降低了肌肉水分含量(P<0.05);
(4)上調(diào)了草魚肌肉TOR和S6K1的m RNA水平(P<0.05),下調(diào)了4EBP1的m RNA水平,促進(jìn)了p-TOR和p-S6K1的蛋白表達(dá)(P<0.05),下調(diào)了p-4EBP1的蛋白表達(dá)(P<0.05),并下調(diào)了蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因Ub、MAFbx、MURF1、FOXO1a和FOXO1b的m RNA水平與Ub的蛋白表達(dá),上調(diào)了AKT的m RNA水平。
綜上所述,飼糧中添加適宜水平的外源蛋白酶K可促進(jìn)草魚生產(chǎn)性能、消化吸收能力以及改善肌肉品質(zhì)。適宜水平的外源蛋白酶K通過促進(jìn)腸道生長(zhǎng)發(fā)育、消化酶和刷狀緣酶活性并上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)增強(qiáng)消化吸收能力;通過提高肌肉系水力、嫩度和風(fēng)味脂肪酸含量改善肌肉品質(zhì);可能通過TOR途徑促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成,并可能通過AKT/FOXO1信號(hào)途徑抑制肌肉蛋白質(zhì)降解從而促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)沉積。根據(jù)PWG、中腸堿性磷酸酶活性和肌肉粗蛋白含量,確定生長(zhǎng)后期草魚飼糧中外源蛋白酶K最適添加量分別為7380.82、7406.44和8590.42 U/kg。
參考文獻(xiàn)
[1]Beneficial effects of phytase and/or protease on growth performance,digestive ability,immune response and muscle amino acid profile in low phosphorus and/or low fish meal gibel carp(Carassius auratus gibelio)diets.Xu Shu-De;Zheng Xin;Dong Xiao-Jing;Ai Qing-Hui;Mai Kang-Sen.Aquaculture,2022
[2]Effect of partially replacing soybean meal with sunflower meal with supplementation of multienzymes on growth performance,carcass characteristics,meat quality,ileal digestibility,digestive enzyme activity and caecal microbiota in broilers..Yaqoob Muhammad Umar;Yousaf Muhammad;Imran Safdar;Hussan Safdar;Iqbal Waqar;Zahid Muhammad Umer;Ahmad Naveed;Wang Minqi.Animal bioscience,2022
[3]Exercise training accelerates UPS-and mTOR-mediated protein turnover of grass carp Ctenopharyngodon idella.Zhang Lihan;Xu Na;Liu Xinlu;Onxayvieng Kommaly;Liu Lu;Tang Rong;Li Dapeng.Aquaculture,2021
[4]Black soldier fly larval meal with exogenous protease in diets for rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)production meeting consumer quality.Bolton C.M.;Muller N.;Hyland J.;Johnson M.P.;Souza Valente C.;Davies S.J.;Wan A.H.L..Journal of Agriculture and Food Research,2021
[5]馮玲.外源蛋白酶K對(duì)生長(zhǎng)后期草魚生產(chǎn)性能、腸道消化吸收能力和肌肉品質(zhì)的影響[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2022.