背景^[1-3]

LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞是一種從人類結(jié)直腸癌組織中分離出來的癌細(xì)胞系。這種細(xì)胞系在實驗室中被廣泛用于研究結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和治療。

LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞

LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞具有以下特點：

形態(tài)特征：LS513細(xì)胞呈長條形，多邊形或不規(guī)則形狀，具有多個核。它們通常在體外培養(yǎng)時形成單層或多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

生長特性：LS513細(xì)胞生長迅速，可以在體外持續(xù)傳代。它們的增殖速度受到生長因子、細(xì)胞密度和其他環(huán)境因素的影響。

分子特征：LS513細(xì)胞表達(dá)多種與結(jié)直腸癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，如表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)等。這些標(biāo)志物有助于研究人員了解腫瘤的生物學(xué)特性和尋找潛在的治療靶點。

藥物敏感性：LS513細(xì)胞對多種化療藥物具有不同程度的敏感性，這為臨床試驗提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，研究人員還可以利用這些細(xì)胞來評估新藥物的安全性和有效性。

LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

應(yīng)用^[4-5]

LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞可以用于GDF15表達(dá)及其H6D遺傳變異與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究

1. GDF15表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系以及轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討我們運用免疫組織化學(xué)方法對250例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中GDF15蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果證實GDF15的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及腫瘤芽數(shù)目正相關(guān),并且GDF15高表達(dá)的患者預(yù)后差。我們體外模擬旁分泌途徑,運用人重組GDF15蛋白對結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、SW480及LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行處理來探討GDF15引起結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

通過Transwell實驗證實,GDF15能夠促進(jìn)HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞的遷移。在隨后進(jìn)行的信號通路實驗中,我們發(fā)現(xiàn),GDF15能使HT29和SW480細(xì)胞Smad2/3和磷酸化的smad2/3蛋白水平表達(dá)增加。并且,在HT29和LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞中,Twist和MMP9蛋白表達(dá)升高,E-cadherin蛋白表達(dá)下降；在SW480細(xì)胞中,Twist、MMP9和Vimentin蛋白表達(dá)升高,E-cadherin蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果表明,GDF15促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移是通過EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)過程來實現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗證Twist等EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是否受Smad2/3的調(diào)控,運用shRNA干擾技術(shù)在HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞中敲低Smad2或Smad3的表達(dá)后,GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)改變的效應(yīng)能夠被逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果說明GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是受Smad2/3調(diào)控的。

GDF15是TGF-β超家族成員,而TGF-β是目前最常用于誘導(dǎo)EMT模型的細(xì)胞因子,這種誘導(dǎo)作用是通過激活Smad2/3來實現(xiàn)的。當(dāng)用GDF15作用于細(xì)胞后,Smad2/3也被激活。因此,我們設(shè)想,GDF15是否也是通過TGF-β通路參與了EMT過程,并引起細(xì)胞的遷移。為了驗證這種假設(shè),我們運用TGF-β受體特異性抑制劑SB-431542預(yù)處理HT29、SW480及LS513人結(jié)直腸癌細(xì)胞后,再用GDF15作用這些細(xì)胞,結(jié)果Smad2/3的表達(dá)沒有增高,E-cadherin的表達(dá)也沒有出現(xiàn)下降。另外,在SB-431542處理后的HT29和SW480細(xì)胞中用GDF15作用后,磷酸化Smad2/3的表達(dá)末見增高。這些結(jié)果說明GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是通過Smad依賴的TGF-β信號通路來完成的。

2. GDF15 H6D多態(tài)性及其突變在結(jié)直腸癌臨床中的意義我們運用焦磷酸測序的方法對250例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和配對正常組織DNA以及198例正常人群血液DNA的GDF15 H6D多態(tài)性位點進(jìn)行檢測,對獲得的數(shù)據(jù)與臨床病理特征及預(yù)后情況進(jìn)行綜合分析,結(jié)果顯示：

(1)H6D多態(tài)性及其突變與GDF15的表達(dá)未見明顯相關(guān)性。

(2)GDF15 H6D多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生存在相關(guān)性,含有D等位基因的人群是結(jié)直腸癌發(fā)病的易感人群。

(3)結(jié)直腸癌中,GDF15 H6D存在突變,這種突變在CG基因型中更容易發(fā)生,有突變的患者死亡率比沒有突變的患者要高。

(4) 在男性結(jié)直腸癌中,GDF15 H6D發(fā)生突變的患者容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且預(yù)后差。

(5) 在結(jié)腸癌患者中,GDF15 H6D含D等位基因的患者容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這類患者死亡率高,純合的HH基因型預(yù)后好。

(6)在直腸癌患者中,有H6D突變的患者容易引起淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高的TNM分期,最后導(dǎo)致死亡的比例增高。

參考文獻(xiàn)

[1]Macrophage inhibitory factor 1 acts as a potential biomarker in patients with esophageal squamous cell carcinoma and is a target for antibody‐based therapy.Xiao‐Bing Wang;;Xing‐Ran Jiang;;Xi‐Ying Yu;;Lin Wang;;Shun He;;Fei‐Yue Feng;;Li‐Ping Guo;;Wei Jiang;;Shih‐Hsin Lu.Cancer Sci,2014

[2]Growth Differentiation Factor-15 as Biomarker in Uterine Sarcomas.Jone Trovik;;Helga Birgitte Salvesen;;Tine Cuppens;;Frederic Amant;;Anne Cathrine Staff.International Journal of Gynecological Cancer,2014

[3]Growth-differentiation factor-15 and tissue doppler?maging in detection of asymptomatic anthracycline cardiomyopathy in childhood cancer survivors.Derya Arslan;;Tugba Cihan;;Dogan Kose;;Husamettin Vatansev;;Derya Cimen;;Yavuz Koksal;;Bulent Oran;;Fikret Akyurek.Clinical Biochemistry,2013

[4]Growth differentiation factor‐15(GDF‐15)suppresses in vitro angiogenesis through a novel interaction with connective tissue growth factor(CCN2).Ramon J.Whitson;;Marshall Scott Lucia;;James R.Lambert.J.Cell.Biochem.,2013

[5]汪靜宇.GDF15表達(dá)及其H6D遺傳變異與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究[D].浙江大學(xué),2016.