背景及概述^[1]

尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNA Glycosylase ，UDG）來(lái)源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。分子量為25kDa，水解尿嘧啶和糖基之間的 N-糖基鍵，在含尿嘧啶的單鏈或雙鏈 DNA 中產(chǎn)生脫嘧啶的位點(diǎn)，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶。它對(duì)RNA無(wú)活性，主要應(yīng)用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。如將PCR核酸擴(kuò)增的高靈敏度和膠體金免疫層析技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、直觀的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，建立了同時(shí)檢測(cè)2種對(duì)蝦病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-膠體金免疫層析檢測(cè)方法，在PCR過(guò)程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶)，極大地控制了遺留污染。該酶作用機(jī)理為：在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP，擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的T全部被U取代，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應(yīng)體系中含U的DNA，有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性，從而保證擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。

單位定義^[1]

在 37°C，60 分鐘內(nèi)從含有尿嘧啶的 DNA 模板中釋放 1 nmol 尿嘧啶所需要的酶量定義為 1 U。

10×Reaction Buffer

200 mM Tris-HCl (pH 8.2， 25°C)， 10 mM EDTA， 100 mM NaCl.

保存緩沖液^[1]

30 mM HEPES-KOH (pH7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM EDTA， 1 mM DTT， 0.05% (v/v) Tween 20， 50% (v/v) 甘油。

質(zhì)量控制^[1]

無(wú)內(nèi)切或外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。

用途^[1]

PCR 交叉污染控制；

糖激酶介導(dǎo)的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)(GMPD)；

位點(diǎn)特異性突變；

蛋白-DNA 相關(guān)作用研究用探針；

SNP 基因分型；

PCR 產(chǎn)物克??；

PCR 產(chǎn)物和 cDNA 中產(chǎn)生單鏈突出末端。

抑制和失活

抑制劑：Baccillus subtilis 噬菌體 PBS2 來(lái)源的 Ugi 蛋白；Baccillus subtilis 噬菌體 phi29來(lái)源的 p56 蛋白。

失活：95°C 加熱 10 分鐘。當(dāng)溫度低于 55°C時(shí)，酶活性部分還原。因此 PCR 擴(kuò)增后，PCR 產(chǎn)物冰浴后可直接上樣凝膠電泳。

備注

Uracil-DNA Glycosylase在DNA中產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)，加熱、堿處理、內(nèi)切核酸酶（特異性切割無(wú)堿基位點(diǎn)）可在該無(wú)堿基位點(diǎn)切割。UDG 發(fā)揮活性不受二價(jià)陽(yáng)離子影響。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 丁東, 熊云, 方勇新, 等. WSSV 和 IHHNV 對(duì)蝦病毒的膠體金免疫層析快速檢測(cè)[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2014, 35(10): 1-7.