背景[1-7]
人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA KIT是一款利用雙抗原夾心法檢測人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的酶聯(lián)免疫試劑盒。雙抗體夾心法，是將含有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗滌一次；加待測抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多余抗體洗除；加入與待測抗原呈特異反應的酶聯(lián)抗體，使形成“夾心”；加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，說明在孔壁上存在相應的抗原。
實驗原理：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗該指標抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
操作步驟：
1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗原的量。
人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA KIT優(yōu)點：
靈敏度：人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA試劑盒有二層含義，1)為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2)為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。
特異性：常用交叉反應率表示。含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應，使測定結(jié)果升高，可能導致假陽性，所以交叉反應是評價其質(zhì)量的關(guān)鍵指標。
精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應小于15%；定量試劑應同時考察線性范圍。
準確度：通過添加回收實驗進行評價。
簡便性：人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA試劑盒指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性實驗中結(jié)果判斷簡單明了，定量試驗結(jié)果計算也應簡單。
安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。
經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進步降低成本，而市場價格比較合理。
操作時注意事項：
1.不同廠家生產(chǎn)的試劑盒因生產(chǎn)工藝和操作方法略有不同，務必按照所用試劑盒嚴格操作，否則容易產(chǎn)生檢測結(jié)果的不確定性。
2.若不同批號人ELISA試劑盒的不同組分(A液或酶工作液)，或不同試劑的不同組分進行交叉使用，有可能出現(xiàn)顯色淺或本底高，花板等情形。
3.反應時間的誤差，做大量標本時，*孔和zui后一孔以及一些特殊標本可能影響較大。
4.臨界值附近標本波動為正?，F(xiàn)象，任何試劑均不可避免。可以考慮將標本做奇數(shù)次復檢。
5.加樣時樣品量誤差，對于陰或很陽的標本影響不大，但對閾值附近的標本影響極大，建議校對加樣器。
應用[8]
人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA 試劑盒可用于人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的ELISA檢測實驗：
例如在腫瘤壞死因子α通過絲裂原活化蛋白激酶激酶6誘導LA795肺腺癌細胞凋亡的實驗中建立TNFα誘導LA795肺腺癌細胞凋亡的細胞模型;使用人胚腎2 93包裝細胞制備絲裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen activatedproteinkinasekinase 6,MKK6)及其結(jié)構(gòu)活性和無活性突變體的重組腺病毒;使用人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的ELISA法測定法檢測細胞內(nèi)MKK6的激酶活性及表達水平。
參考文獻
[1]A tyrosine kinase profile of prostate carcinoma.Robinson D,He F,Pretlow T,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1996
[2]Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis.Xia Z,Dickens M,Raingeaud J,et al.Science.1995
[3]Role of p38 protein kinase in heatinduced raw cells apoptosis.Zhang L,Zhang L,Jiang Y,et al.Chinese Medical Journal.2000
[4]Mitogen-activated protein kinase:conservation of a three-kinase module from yeast to human.Widmann C,Gibson S,Jarpe MB,et al.Physiological Reviews.1999
[5]Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.Wang Y,Huang S.Drug Discovery Today.2000
[6]Inhibition of extracellular signalregulated kinase enhances ischemia/reoxygenation-induced apoptosis in cultured cardiac myocytes and exaggerates reperfusion injury in isolated perfused heart.Yue TL,Wang C,Gu JL,et al.Circulation Research.2000
[7]Apoptosis signaling pathway in T cells is composed of ICE/Ced-3 family protease and MAP kinase 6b.Huang S,Jiang Y,Li Z,et al.Immunity.1997
[8]劉愛華,鄧鵬,姜勇.腫瘤壞死因子α通過絲裂原活化蛋白激酶激酶6誘導LA795肺腺癌細胞凋亡[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003(02):27-31.