背景^[1-3]

兔冠狀動脈平滑肌細胞是一種實驗細胞系，通常用于研究心血管系統(tǒng)的生物學和藥理學。這種細胞系具有收縮和舒張血管的功能，是心血管系統(tǒng)中的重要組成部分。

兔冠狀動脈平滑肌細胞可以用于研究心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展機制，以及藥物對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。這種細胞系還可以用于研究平滑肌細胞的生理和藥理特性，以及平滑肌細胞與其他類型細胞之間的相互作用。

兔冠狀動脈平滑肌細胞

兔冠狀動脈平滑肌細胞培養(yǎng)操作

1)復蘇兔冠狀動脈平滑肌細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)兔冠狀動脈平滑肌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)兔冠狀動脈平滑肌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應用^[4-5]

兔冠狀動脈平滑肌細胞可以用于用二仙含藥血清通過雌激素受體抑制Ox-LDL誘導的冠狀動脈平滑肌細胞增殖

在細胞水平探究二仙含藥血清對氧化型低密度脂蛋白誘導的冠狀動脈平滑肌細胞增殖的影響,并探討其機制。

方法:1.細胞培養(yǎng):應用兔冠狀動脈平滑肌細胞,置于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),實驗細胞為第4-6代細胞(均處于對數(shù)生長期)。

2. 實驗步驟:首先給予不同濃度Ox-LDL進行誘導兔冠狀動脈平滑肌細胞,并行CCK-8篩選出最佳濃度為50mg/L Ox-LD;并篩選出10%二仙含藥血清為最佳濃度;正式實驗分組為9組:正常細胞組、模型組(Ox-LDL)、陽性對照組(17-β雌二醇)、陰性對照組(大鼠陰性血清)、二仙含藥血清組、ICI182780組、G15組、二仙含藥血清+ICI182780組、二仙含藥血清+G15組,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),CCK-8法檢測細胞增殖,流式細胞術(shù)(Flou-3)測定鈣離子濃度,熒光定量PCR檢測細胞中GPER30、ERK1/2、AKT m RNA表達,ELISA、Western blot法測定GPER30、ERK1/2、AKT蛋白表達。

結(jié)果:1.倒置顯微鏡觀察二仙含藥血清對Ox-LDL誘導的兔冠狀動脈平滑肌細胞形態(tài)學影響與正常RCSMCs比較,在Ox-LDL的作用下RCSMCs細胞胞體增大,由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形,而二仙含藥血清干預后細胞胞體變小,加入ICI182780及G15后二仙含藥血清這一作用減弱。

3. CCK-8法檢測二仙含藥血清對Ox-LDL誘導的兔冠狀動脈平滑肌細胞增殖活性的影響與正常細胞比較,Ox-LDL明顯促進細胞增殖,而二仙含藥血清干預后抑制了Ox-LDL對細胞的促進作用,并且二仙含藥血清的這一作用可以被ICI182780及G15阻斷。

4. 流式細胞術(shù)檢測二仙含藥血清對Ox-LDL誘導的兔冠狀動脈平滑肌細胞中鈣離子水平的影響與模型組比較,二仙含藥血清組明顯降低了RCSMCs鈣離子濃度;與二仙含藥血清組比較,二仙含藥血清+ICI182780組及二仙含藥血清+G15組均阻斷了二仙含藥血清對平滑肌增殖的抑制作用。

5. 熒光PCR法檢測二仙含藥血清對Ox-LDL誘導的兔冠狀動脈平滑肌細胞GPER30、ERK1/2、AKT m RNA表達水平的影響與模型組比較,二仙含藥血清組GPER30 m RNA表達明顯升高,而對ERK1/2、AKT m RNA表達無明顯影響;與二仙含藥血清組比較,二仙含藥血清+ICI182780組、二仙含藥血清+G15組GPER30 m RNA表達明顯減少,而ERK1/2、AKT m RNA表達分別未見明顯變化;說明在基因水平上二仙含藥血清促進了GPER30基因表達而對ERK1/2、AKT無明顯作用,且二仙含藥血清的這一作用可以被ICI182780及G15阻斷。

6. ELISA法檢測二仙含藥血清對Ox-LDL誘導的兔冠狀動脈平滑肌細胞GPER30、ERK1/2、AKT等蛋白表達的影響與模型組比較,二仙含藥血清組GPER30蛋白表達水平明顯升高,而ERK1/2、AKT蛋白表達水平明顯降低;與二仙含藥血清組比較,二仙含藥血清+ICI182780組、二仙含藥血清+G15組GPER30蛋白表達水平均明顯下降,而ERK1/2、AKT蛋白表達水平均明顯升高;說明在蛋白水平上二仙含藥血清明顯促進了GPER30蛋白表達而抑制ERK1/2、AKT蛋白表達,且二仙的這一作用可以被ICI182780及G15阻斷。

參考文獻

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