尿苷酸是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應(yīng)用于不同領(lǐng)域。作為母乳中含量第二大的核苷酸，它是嬰幼兒食品中常用的添加劑；能參與肝臟解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸苷的合成，也可作為膜磷脂的前體提高腦部胞苷二磷酸膽堿和乙酰膽堿水平；以其為前體的碘苷也已廣泛應(yīng)用于臨床。
傳統(tǒng)合成方法
現(xiàn)有的尿苷酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法和酶解法。
化學(xué)合成法包括磷酸化法和脫氨法，其中是磷酸化法是以尿苷為原料，將2，3位的羥基保護(hù)后，再使用有毒的POCl3試劑作為磷酸化試劑合成尿苷酸，整個(gè)過(guò)程收率較高但是生產(chǎn)安全性差，容易造成污染且雜質(zhì)較多。脫氨法是以胞苷酸為原料，在酸性條件下經(jīng)過(guò)脫氨反應(yīng)，將胞苷酸直接轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜍账?，整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)單高效，但由于原料胞苷酸價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本較高。
酶解法是利用核酸酶水解核糖核酸(RNA)得到四中單核苷酸(腺苷酸、鳥(niǎo)苷酸、胞苷酸和尿苷酸)混合物后，再經(jīng)過(guò)離子交換法分離精制得到尿苷酸。與化學(xué)法相比，酶解法具有原料成本低、反應(yīng)安全、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但是存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，分離精制工序復(fù)雜，加工成本高等缺陷。
酶催化法
為了解決上述問(wèn)題，專(zhuān)利 CN109161536B 提出了一種尿苷酸制備的方法，具體操作如下：
(1)在大腸桿菌E.coli BL21(ACCC11171)中異源表達(dá)尿苷激酶編碼基因，構(gòu)建出具有尿苷激酶活性的菌株E.coli UDK；
(2)在大腸桿菌E.coli BL21(ACCC11171)中異源表達(dá)聚磷酸激酶編碼基因，構(gòu)建出具有聚磷酸激酶活性的菌株E.coli PPK；
(3)將上述構(gòu)建的重組菌株E.coli UDK和E.coli PPK分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活性的尿苷激酶和聚磷酸激酶；
(4)將步驟(3)中培養(yǎng)獲得的具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大腸桿菌細(xì)胞(E.coli UDK和E.coli PPK細(xì)胞)進(jìn)行破碎獲得粗酶液；
(5)將步驟(4)中獲得的粗酶液與50-150mM的尿苷溶液或尿苷發(fā)酵液、50-150mM的六偏磷酸鈉、50-150mM的硫酸鎂、3-9mM的ATP混合，在pH 8.0，30℃的反應(yīng)條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)合成尿苷酸。
此方法原料成本低廉，產(chǎn)物單一易于分離純化，尿苷酸產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率具有顯著優(yōu)勢(shì)。