背景[1-3]
RCC4人腎癌細(xì)胞系是一種來源于人腎癌的細(xì)胞系，具有多種生物學(xué)特性和功能。以下是一些關(guān)于RCC4人腎癌細(xì)胞系的信息：
來源：RCC4人腎癌細(xì)胞系最初由Dr.J.A.Hartwell于1982年從一名患有腎癌的男性患者的腫瘤組織中分離出來。
培養(yǎng)條件：RCC4人腎癌細(xì)胞系通常在DMEM(高糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。細(xì)胞生長在37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。
生物學(xué)特性：RCC4人腎癌細(xì)胞系具有較高的增殖能力和較強(qiáng)的侵襲性，可用于研究腎癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制。此外，RCC4細(xì)胞系還被廣泛用于藥物篩選和毒性評估實驗中。
基因表達(dá)：RCC4人腎癌細(xì)胞系表達(dá)一些與腎癌相關(guān)的基因，如KRAS、NRAS、BRAF、TP53、SMAD4等。這些基因突變在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。
應(yīng)用：RCC4人腎癌細(xì)胞系已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腎癌的基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)和臨床前研究中。例如，它可以用于研究腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性等生物學(xué)特性；也可以用于篩選新的抗癌藥物和評估其療效和安全性。
RCC4人腎癌細(xì)胞系
RCC4人腎癌細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇RCC4人腎癌細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)RCC4人腎癌細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)RCC4人腎癌細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
RCC4人腎癌細(xì)胞系可以用于自噬聯(lián)合mTOR通路或磷酸戊糖途徑雙重抑制對腎細(xì)胞癌治療的研究
自噬聯(lián)合磷酸戊糖途徑雙重抑制對腎癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制目的：探索以RCC4為代表的具有高mTOR、高自噬水平腎癌細(xì)胞在抑制自噬后代謝通路的變化,并研究針對該代謝通路以及自噬雙重抑制后對此類腎癌細(xì)胞的治療作用。
方法：為探索RCC4腎癌細(xì)胞在自噬抑制劑作用下代謝通路的改變,我們對氯喹和對照劑(DMSO)處理后的RCC4人腎癌細(xì)胞系進(jìn)行了代謝譜分析。通過對結(jié)果進(jìn)行代謝組富集分析(Metabolite Set Enrichment Analysis,MSEA),擬發(fā)現(xiàn)治療組與對照組見差異最大的代謝通路改變,并通過給予RCC4人腎癌細(xì)胞系相應(yīng)的抑制劑后檢測細(xì)胞,研究氯喹與糖代謝抑制劑是否對RCC4人腎癌細(xì)胞系增殖具有協(xié)同抑制作用。因腫瘤中自噬及代謝通路的改變與氧化應(yīng)激關(guān)系密切,我們通過檢測細(xì)胞的氧消耗和營養(yǎng)物消耗評價RCC4人腎癌細(xì)胞系在自噬被抑制后代謝的改變。
同時,通過對pNFxB的分析進(jìn)一步了解自噬與代謝雙重抑制對RCC4人腎癌細(xì)胞系產(chǎn)生抑制的可能機(jī)制。結(jié)果：RCC4腎癌細(xì)胞在應(yīng)用氯喹前后代謝通路具有明顯變化,其中磷酸戊糖途徑(PPP)的變化最為明顯。PPP途徑活性在RCC4人腎癌細(xì)胞系自噬被抑制后明顯升高,而其代謝產(chǎn)物的含量也顯著增多。應(yīng)用PPP途徑抑制劑6-氨基煙酰胺(6AN)后,RCC4人腎癌細(xì)胞系的增殖受抑制,而氯喹顯著增加了RCC4人腎癌細(xì)胞系對6AN治療的敏感性。氯喹與6AN對RCC4人腎癌細(xì)胞系具有協(xié)同性抑制作用。RCC4人腎癌細(xì)胞系的自噬被抑制后,其對葡萄糖的攝取明顯增多,而乳酸升高不明顯,提示糖酵解并不是其糖代謝改變的主要途徑,同時,PPP途徑代謝產(chǎn)物在氯喹實驗組顯著更高。通過對pNF(?)B的分析,我們發(fā)現(xiàn)氯喹和6AN均使RCC4人腎癌細(xì)胞系中pNF(?)B增加,可能通過炎性體(Inflammasome)途徑抑制RCC4人腎癌細(xì)胞系增殖。
結(jié)論：RCC4腎癌細(xì)胞具有高mTOR、高自噬水平的特點,其對氯喹聯(lián)合雷帕霉素治療敏感性較低。通過對氯喹處理前后RCC4人腎癌細(xì)胞系的代謝譜分析發(fā)現(xiàn),PPP途徑增高可能是其產(chǎn)生抵抗的機(jī)制。聯(lián)合應(yīng)用氯喹和PPP抑制劑6-AN可對RCC4人腎癌細(xì)胞系產(chǎn)生協(xié)同抑制作用,同時,氯喹和6 AN均使細(xì)胞內(nèi)NFxB水平增高,提示氯喹聯(lián)合6AN對RCC4人腎癌細(xì)胞系增殖的抑制作用可能通過炎性體介導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)
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