背景[1-3]
人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒是一種用于檢測人血清中甲狀腺素抗體濃度的試劑盒。甲狀腺素抗體是人體免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生的針對甲狀腺激素的抗體，通常在自身免疫性甲狀腺疾病中出現(xiàn)，如Graves病和Hashimoto's甲狀腺炎。
ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)是一種常用的生物化學(xué)檢測方法，它利用酶作為標(biāo)記，通過特定的反應(yīng)來檢測樣本中特定物質(zhì)的濃度。在人甲狀腺素抗體(TAb)ELISA試劑盒中，將含有甲狀腺素抗體的樣本與包被有甲狀腺素的微孔板進(jìn)行反應(yīng)，如果樣本中含有TAb，則TAb會與包被的甲狀腺素結(jié)合。然后，再添加與TAb結(jié)合的酶標(biāo)記二抗，使酶與二抗結(jié)合。最后，添加底物，酶會催化底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，通過測定顏色的深淺可以確定樣本中TAb的濃度。
人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒
人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒操作步驟
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。
應(yīng)用[4][5]
人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒可以用于化學(xué)發(fā)光免疫分析在游離甲狀腺素測定中的應(yīng)用研究
圍繞游離甲狀腺素的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立和優(yōu)化開展了一些研究。通過結(jié)合抗體-抗原的高特異免疫分析技術(shù)、高效的酶標(biāo)記技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測體系,建立了測定體液內(nèi)甲狀腺激素的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,對大批量臨床樣品篩選、檢測和體外診斷試劑的研發(fā)有一定臨床應(yīng)用價值和學(xué)術(shù)意義。首先,簡要介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理和甲狀腺激素的種類、來源和作用功能,并對游離甲狀腺激素的檢測技術(shù)和方法進(jìn)行了綜述。其次,建立了一種簡單鑒定小分子的酶標(biāo)記物質(zhì)量方法,通過實驗證明,本方法可以在選用原料時保證酶標(biāo)記物質(zhì)量的合格,從而保證了后續(xù)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。再次,建立了一種基于磁性微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定人血清中的游離甲狀腺素的方法,該方法具有靈敏度高、高特異、快速、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等特點。
本方法使用人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒辣根過氧化物酶標(biāo)記的甲狀腺素類似物與血清中的游離甲狀腺素共同競爭結(jié)合羊抗甲狀腺素抗體；表面包被有抗異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)的磁性微粒子用作免疫反應(yīng)的固相載體和分離劑,以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化H2O2-luminol化學(xué)發(fā)光體系作為檢測體系；對免疫反應(yīng)的試驗條件及各項物理化學(xué)參數(shù)如：反應(yīng)溫度、溫育時間、稀釋度、磁性微粒子和發(fā)光底物的用量等進(jìn)行了測定和優(yōu)化。在最佳條件下,該方法的線性范圍是0-122 pmol L-1,檢測限為0.25 pmol L-1;批內(nèi)變異和批間變異均小于14.6%；通過本法對實際血清樣本檢測,并將結(jié)果與商品化試劑盒的測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析,其相關(guān)系數(shù)r2=0.9592,證實本法可用于人血清中游離甲狀腺素的臨床測定。
最后,使用通用人甲狀腺素抗體(TAb)Elisa試劑盒二抗固相法制備固相抗甲狀腺素抗體,使用魯米諾-雙氧水-辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光體系作為檢測體系,發(fā)展了一種通用二抗固相化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法并將其應(yīng)用于臨床游離甲狀腺素的測定。驢抗羊IgG(即二抗)通過物理吸附包被在96孔聚苯乙烯微孔板上,對其進(jìn)行封閉后,作為一個通用的固相應(yīng)用于各種物質(zhì)的免疫分析。向該固相中加入甲狀腺素的多克隆羊源抗體,樣品抗原和酶標(biāo)記物后進(jìn)行溫育反應(yīng),羊抗甲狀腺素抗體通過與二抗之間的免疫反應(yīng)被間接固定化在聚苯乙烯微孔板上,樣品抗原和酶標(biāo)記物競爭結(jié)合羊抗甲狀腺素抗體,形成免疫復(fù)合物,通過測定酶促化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強度來達(dá)到定量檢測的目的。對一些相關(guān)參數(shù)和實驗條件諸如免疫試劑的稀釋度、溫育時間、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時間以及底物液加樣體積進(jìn)行了考查和優(yōu)化,并對建立的方法進(jìn)行了評價。
參考文獻(xiàn)
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