背景[1-3]
MUSK抗體也被稱為肌肉特異性酪氨酸激酶（Muscle-specific Kinase，簡稱MuSK）抗體，是一種針對(duì)MuSK蛋白的特異性抗體。MuSK是一種在骨骼肌中表達(dá)的跨膜蛋白，它參與突觸分化和神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）的維持機(jī)制。具體來說，MuSK蛋白在神經(jīng)接頭處形成，對(duì)乙酰膽堿受體（AChR）的聚集以及乙酰膽堿磷酸化起關(guān)鍵作用。
MUSK抗體的檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上有重要意義，因?yàn)樗挥糜谠\斷一種特定的自身免疫性疾病——抗MuSK抗體陽性重癥肌無力（MuSK MG）。這種疾病的特點(diǎn)是患者體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)MuSK蛋白的自身抗體，這些抗體會(huì)影響神經(jīng)肌肉接頭的正常功能，導(dǎo)致骨骼肌無力等癥狀。MuSK MG患者約占全部重癥肌無力患者的5%～8%。
MUSK抗體
在結(jié)構(gòu)上，MuSK蛋白由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。其中，胞外結(jié)構(gòu)包含3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域和1個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（也稱為frizzled樣結(jié)構(gòu)域）。而胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域則由短的近膜區(qū)、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)含有8個(gè)氨基酸的羧基端序列組成。
在功能上，MuSK蛋白和MuSK抗體在神經(jīng)肌肉傳遞中起著重要作用。MuSK蛋白參與AChR的聚集和維持NMJ功能完整，而MuSK抗體則可能影響這一過程，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞障礙。此外，免疫球蛋白樣1和2區(qū)介導(dǎo)的agrain-Lrp4-MuSK信號(hào)以及半胱氨酸富集區(qū)介導(dǎo)的Wnt-MusK-Dishevelled信號(hào)都參與了乙酰膽堿受體簇集過程。
應(yīng)用[4][5]
MUSK抗體可以用于PTPRR調(diào)節(jié)MuSK去磷酸化抑制乙酰膽堿受體富集的相關(guān)研究
尋找可以使肌肉特異性受體型酪氨酸激酶(Muscle,skeletal receptor tyrosine-protein kinase,MuSK)去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,探究MuSK的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)及受該酪氨酸磷酸酶調(diào)節(jié)的酪氨酸位點(diǎn),探討該酪氨酸磷酸酶通過使MuSK去磷酸化對(duì)乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AChR)富集的調(diào)節(jié)作用,拓展MG病因研究,并為治療提供新的靶點(diǎn)及思路。
研究方法:用10種酪氨酸磷酸酶質(zhì)粒與MuSK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,通過MUSK抗體蛋白質(zhì)免疫印跡及免疫沉淀技術(shù)篩選出可使MuSK去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,免疫共沉淀檢測(cè)該酪氨酸磷酸酶是否能與MuSK形成蛋白復(fù)合物;Flag-MuSK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Flag-Beads富集、純化MuSK蛋白后行聚丙烯酰氨凝膠電泳,考馬斯亮藍(lán)染色并回收MuSK蛋白,行質(zhì)譜分析以檢測(cè)MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn);根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果,運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建單/多位點(diǎn)突變的MuSK質(zhì)粒,突變質(zhì)粒與篩選出的酪氨酸磷酸酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡確定該酪氨酸磷酸酶使MuSK去磷酸化的酪氨酸位點(diǎn);利用慢病毒包裝技術(shù),構(gòu)建該酪氨酸磷酸酶野生型/突變型過表達(dá)的C2C12細(xì)胞系,C2C12細(xì)胞長至90%后更換為分化培養(yǎng)基以誘導(dǎo)細(xì)胞融合并分化成肌管細(xì)胞,用Agrin刺激細(xì)胞24h誘導(dǎo)AChR在細(xì)胞膜富集,4%甲醇固定并用1 mM的AlexaFluor 555-conjugated alphabungarotoxin標(biāo)記AChR 24小時(shí),激光共聚焦熒光顯微鏡下觀測(cè)熒光標(biāo)記的肌管細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)AChR富集的數(shù)量及長度。通過比較野生型C2C12、野生型酪氨酸磷酸酶高表達(dá)C2C12、突變型酪氨酸磷酸酶高表達(dá)C2C12的AChR富集,探究酪氨酸磷酸酶對(duì)AChR富集的調(diào)節(jié)作用。
MUSK抗體研究結(jié)果:經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn),酪氨酸磷酸酶PTPRR可使MuSK顯著去磷酸化,免疫共沉淀顯示PTPRR可與MuSK形成蛋白復(fù)合物;質(zhì)譜分析表明MuSK蛋白的Y553、Y750、Y754、Y755四個(gè)位點(diǎn)的酪氨酸殘基可被磷酸化修飾,PTPRR可使其中的Y754位點(diǎn)去磷酸化;經(jīng)統(tǒng)計(jì)表明,高表達(dá)野生型PTPRR的C2C12肌管細(xì)胞相較于野生型C2C12細(xì)胞AChR富集的數(shù)量減少、長度變短,而高表達(dá)D554A突變型PTPRR的C2C12細(xì)胞較于野生型C2C12細(xì)胞AChR富集的數(shù)量增多、長度變長(數(shù)據(jù)來源于3次以上實(shí)驗(yàn),每組肌管數(shù)量≥45,unpaired t test,P<0.05)。
參考文獻(xiàn)
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