背景及概述^[1-2]

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中最常見而且數(shù)量較多的一種細(xì)胞，位于膠原纖維近旁并依附于其上。此細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)可隨其功能狀態(tài)的不同而改變。在功能活動(dòng)旺盛時(shí)，成纖維細(xì)胞的胞體較大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圓形，核染色質(zhì)較少，著色淺，核仁明顯。胞質(zhì)較多，弱鹼性，內(nèi)含豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核蛋白體、高爾基復(fù)合體以及微絲和微管等結(jié)構(gòu)，表明此種細(xì)胞具有合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和多糖蛋白，形成膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維和基質(zhì)的作用。在相對(duì)靜止或功能活動(dòng)不活躍時(shí)的細(xì)胞，稱為纖維細(xì)胞。這種細(xì)胞比成纖維細(xì)胞小，輪廓不甚清楚，多呈梭形。胞質(zhì)少，弱嗜酸性，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及其它細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)。這表明纖維細(xì)胞是功能活動(dòng)不活躍的細(xì)胞。但在一定條件下，如創(chuàng)傷修復(fù)，結(jié)締組織再生時(shí)，纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為功能活躍的成纖維細(xì)胞，積極參與合成和分泌蛋白質(zhì)，形成纖維和基質(zhì)?！∨咛コ衫w維細(xì)胞飼養(yǎng)層是體外成功培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(ES)細(xì)胞的必要條件。主要分泌某些細(xì)胞因子如成纖維細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子，以促進(jìn)ES細(xì)胞增殖以及抑制分化。同時(shí)又能分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)等。胰島細(xì)胞從它們自然的細(xì)胞外基質(zhì)中分離出來將可能經(jīng)歷一種奇特的凋亡死亡過程。為分離的胰島移植前提供合適的微環(huán)境，許多學(xué)者采用小腸粘膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、垂體前葉細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞與胰島共同培養(yǎng)均可使“目的細(xì)胞”的存活和功能情況明顯改善。有研究對(duì)影響大鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng)的一些因素和方法進(jìn)行探索，建立穩(wěn)定的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系。

培養(yǎng)^[2]

1. 原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的制備

將性成熟雌鼠(6～8周齡)與雄鼠(8周齡)按2∶1比例合籠，每天早上觀察雌鼠陰道口，有乳白色或淡黃色膠凍狀物(陰道栓)者即認(rèn)定為懷孕0.5d。取妊娠10.5～18.5d的孕鼠，制備上清液。重復(fù)其消化過程，直至上清澄清為止。合并各次上清，1000r/min離心5min，棄上清，以完全培養(yǎng)液吹吸懸浮沉淀成單細(xì)胞懸液，加入75cm2培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

2. 臺(tái)盼蘭排斥實(shí)驗(yàn)檢測原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞存活率

將大鼠胚胎成纖維細(xì)胞s單細(xì)胞懸液細(xì)胞密度調(diào)整為106細(xì)胞/mL。取9滴細(xì)胞懸液滴到載波片上，加1滴0.4%的臺(tái)盼蘭溶液，混勻。3min之內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別記數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)(注：鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染)。根據(jù)公式：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100。

3. 二代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)　

原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶后消化傳代，消化液為0.25%胰酶，在顯微鏡下觀察消化過程，見細(xì)胞變圓后立即以完全培養(yǎng)液(含10%FBS、100U/mL青霉素和80U/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液)終止消化。

4. 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇　

凍存液為1份二甲基亞砜(DMSO)與9份完全培養(yǎng)液混合，凍存與復(fù)蘇按常規(guī)進(jìn)行。

3. 細(xì)胞生長曲線測定

①將接種前的一部分均勻大鼠胚胎成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加樣200μL，接種9排，每排5孔，測定1排/d；②將96孔板置于37℃孵箱里培養(yǎng)1d；③培養(yǎng)終止前4h向所測排的每孔加入MTT20μL；④置于37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4h；⑤4h后吸去上清，加入150μLDMSO終止；⑥將96孔板置于酶標(biāo)儀上，490nm測定吸光度。

4. 大鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞爬片

將P0、P1、P2、P3代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞接種后留少許均勻大鼠胚胎成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸液接種于鋪有蓋玻片的6孔板，每孔加樣2～3mL(鋪滿每孔底部即可)。37℃孵箱培養(yǎng)1～2d。蓋玻片上細(xì)胞密度適中，可以終止培養(yǎng)。細(xì)胞爬片用PBS清洗3次；95%的酒精固定15min。PBS清洗3次。晾干后以中性樹膠將無細(xì)胞側(cè)貼于載玻片，待用。

5. 爬片染色

固定后的爬片以蒸餾水洗滌，PBS洗3次。常規(guī)HE染色：蘇木素中染色2～5min。流水清洗，1%鹽酸溶液分色。1%氨水藍(lán)化；流動(dòng)自來水清洗爬片3次。0.5%伊紅水溶液中1～5min。爬片進(jìn)入蒸餾水中清洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片。免疫細(xì)胞化學(xué)染色按試劑盒說明書進(jìn)行，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。陰性對(duì)照略去一抗其余步驟不變。

8.結(jié)果

1）細(xì)胞生長曲線

由圖1可見第3代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)至第3d時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞快速增加，至6d時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰，未經(jīng)明顯的平臺(tái)期，便進(jìn)入衰退期，細(xì)胞數(shù)量下降，可見有細(xì)胞漂浮。

2）生長形態(tài)觀察

胚胎組織經(jīng)胰酶消化解聚后呈球形。大鼠胚胎成纖維細(xì)胞在體外為貼壁生長型細(xì)胞，大小不均，異質(zhì)性較大，原代培養(yǎng)約4～12h開始貼壁，胞質(zhì)向外伸出偽足而形成梭形、多邊形或不規(guī)則異形等形狀，中間有卵圓形核。原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞中有時(shí)雜細(xì)胞較多，可能混雜有上皮樣等細(xì)胞(圖2)。傳兩代后(P3)細(xì)胞才較純，第五代(P5)以后，細(xì)胞開始老化。可見細(xì)胞偽足增多，并有分叉，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞之間空隙較大(圖3、4)。

3）原代消化后細(xì)胞存活率　

臺(tái)盼蘭染色后計(jì)細(xì)胞總數(shù)共1800個(gè)，其中著色細(xì)胞(死細(xì)胞)106個(gè)，未著色細(xì)胞(活細(xì)胞)1694個(gè)，細(xì)胞存活率94.11%。

4）胚胎日齡胎鼠對(duì)大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的影響

10.5d、13.5d、18.5d齡小鼠胚胎均可分離得到成纖維細(xì)胞，但10.5d鼠胚太小，不利操作，分離所得細(xì)胞數(shù)量少；18.5d鼠胚有骨細(xì)胞的混雜，分離所得成纖維細(xì)胞中雜細(xì)胞較多，且易老化；13.5d胎鼠分離所得細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞較18.5d胎鼠少，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。

5）凍存對(duì)大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的影響

對(duì)凍存的P1和P2代細(xì)胞復(fù)蘇后的培養(yǎng)情況觀察發(fā)現(xiàn)P1代細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)要優(yōu)于P2代，且復(fù)蘇細(xì)胞傳代后與未經(jīng)凍存的細(xì)胞相似，不影響其活性和功能。

6）爬片染色結(jié)果

大鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)HE染色后細(xì)胞呈梭形或多邊形。染為粉紅色。核圓或橢圓形居中，著紫藍(lán)色，核仁明顯。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：原代大鼠胚胎成纖維細(xì)胞中絕大部分細(xì)胞vimentin和fibrinectin免疫反應(yīng)陽性，有少部細(xì)胞呈ck18陽性。免疫反應(yīng)產(chǎn)物位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒或纖維狀。細(xì)胞核呈籃色居中，核仁明顯。

主要參考資料

[1] 運(yùn)動(dòng)解剖學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)大辭典

[2] 大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性