背景^[1-3]

小鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠促卵泡素(FSH)水平。用純化的小鼠促卵泡素(FSH)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入抑瘤素M(OSM)，再與HRP標(biāo)記的抑瘤素M(OSM)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抑瘤素M(OSM)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠促卵泡素(FSH)濃度。

小鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒

小鼠促卵泡素(FSH)Elisa試劑盒檢測前準(zhǔn)備工作：

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象；放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶完全溶解后再配置洗滌液?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

小鼠促卵泡素(FSH)Elisa試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5.其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

小鼠促卵泡素(FSH)Elisa試劑盒操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2．設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

3．樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

小鼠促卵泡素(FSH)Elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果計算：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

應(yīng)用^[4][5]

小鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒可以用于長效重組促卵泡素支持高質(zhì)量的小鼠卵泡體外發(fā)育和卵母細(xì)胞體外成熟

研究中提出了一種具有較長半衰期的新型重組FSH(KN015)作為經(jīng)典FSH的替代品。KN015在小鼠卵泡二維體外培養(yǎng)的過程中支持初級卵泡到排卵前卵泡的發(fā)育,效率高于普通的FSH(果納芬),并且提高卵母細(xì)胞的受精后發(fā)育率。KN015的使用讓我們可以比較卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在體內(nèi)和體外不同階段的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組變化。KN015促進(jìn)了mRNA在生長的卵母細(xì)胞中的積累,并在體外阻止了顆粒細(xì)胞的自發(fā)黃素化。這項(xiàng)研究中對轉(zhuǎn)錄組變化的分析表明,體內(nèi)卵母細(xì)胞在成熟過程中母源mRNA的降解效率比體外卵母細(xì)胞高。KN015促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟過程中母源mRNA的降解,促進(jìn)卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟,提高胚胎的發(fā)育潛力。這些發(fā)現(xiàn)建立了卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育的關(guān)鍵階段的新轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),可能有助于KN015成為一種有效的和可商用的激素,從而能夠在體外卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育中進(jìn)行優(yōu)化。

探究新型重組FSH(KN015)是否比普通FSH更能支持卵泡體外培養(yǎng)和卵母細(xì)胞體外成熟,及其作用機(jī)制。研究方法:通過轉(zhuǎn)錄組分析體內(nèi)體外各級卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)情況,qPCR驗(yàn)證卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平,免疫熒光分析卵母細(xì)胞細(xì)胞核以及紡錘體的形態(tài)。研究內(nèi)容:1.不同卵泡刺激素處理下體外培養(yǎng)卵泡成熟率以及卵母細(xì)胞成熟的定量和鑒定,及使用小鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒探究卵泡體外培養(yǎng)合適的FSH濃度。2.比較卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在體內(nèi)和體外不同階段的轉(zhuǎn)錄組變化。3.不同卵泡刺激素處理下體外培養(yǎng)完全生長的卵母細(xì)胞成熟情況以及卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的基因表達(dá)情況。

參考文獻(xiàn)

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[5]李妍楚.長效重組促卵泡素支持高質(zhì)量的小鼠卵泡體外發(fā)育和卵母細(xì)胞體外成熟[D].南方醫(yī)科大學(xué),2022.