HLX1基因在成人組織中表達(dá)量低，且天然HLX1蛋白難以大量獲取，因此需通過原核表達(dá)系統(tǒng)重組制備HLX1融合蛋白作為抗原，免疫實(shí)驗(yàn)動物（如家兔）誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性HLX1抗體。HLX1抗體是針對人H2.0樣同源盒基因編碼蛋白制備的特異性免疫抗體，主流為兔源多克隆抗體。

制備方法^[1]

一、HLX融合蛋白的表達(dá)與純化（抗原制備）

原核表達(dá)載體構(gòu)建以含人HLX基因ORF區(qū)（1467bp）的pMD19-T-HLX質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增HLX目的片段，經(jīng)SacⅠ 和HindⅢ 雙酶切后，定向克隆至原核表達(dá)載體pQE30（含 6×His標(biāo)簽），構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-HLX；將其轉(zhuǎn)化至E.coli M15 感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)酶切、測序鑒定確保載體構(gòu)建正確。

HLX融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取pQE30-HLX 陽性單菌落，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD???≈0.6時(shí)，加入終濃度 1.5mmol/L的IPTG，于25℃振蕩培養(yǎng)6h（優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)條件）；收集菌液，經(jīng)超聲裂解（冰浴條件）、10000rpm離心20min取上清，獲得含可溶性HLX融合蛋白的粗提液。

HLX融合蛋白的純化采用Ni?-IMAC 親和層析柱純化：先用pH8.0的結(jié)合緩沖液（含50mM NaH?PO?、300mM NaCl、10mM咪唑）平衡柱子，上樣粗提液并重復(fù)過柱；再用pH8.0的洗滌緩沖液（含20mM咪唑）洗滌去除雜蛋白；最后用pH8.0的洗脫緩沖液（含 250mM 咪唑）洗脫目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證純度達(dá)90%以上，作為免疫抗原備用。

二、免疫家兔：多克隆HLX1抗體的誘導(dǎo)產(chǎn)生

實(shí)驗(yàn)動物與免疫方案選用健康家兔（購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心），采用“基礎(chǔ)免疫 + 加強(qiáng)免疫”的階梯式免疫策略：

基礎(chǔ)免疫：取純化的HLX融合蛋白100μg，與等體積弗氏完全佐劑充分乳化（滴入冷水呈完整液滴視為乳化完全），于家兔背部多點(diǎn)皮下注射；

加強(qiáng)免疫：首次免疫后每10天進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，共5次；加強(qiáng)免疫時(shí)改用HLX融合蛋白與弗氏不完全佐劑乳化，劑量同基礎(chǔ)免疫；

末次加強(qiáng)與取血：第5次加強(qiáng)免疫后，用100μg HLX融合蛋白（無佐劑）靜脈注射加強(qiáng)，3天后通過心臟穿刺取血，收集抗血清（含HLX1抗體）。

血清預(yù)處理收集的抗血清于4℃靜置過夜，12000rpm離心10min去除沉淀，上清即為粗制HLX1抗體，可直接用于后續(xù)效價(jià)與特異性鑒定，或進(jìn)一步純化。

應(yīng)用實(shí)例

許燕在轉(zhuǎn)錄因子Hlx(HLX1)對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)及腦/脊髓損傷、胃癌的關(guān)聯(lián)研究中，HLX1抗體主要用于驗(yàn)證Hlx基因/蛋白的表達(dá)水平，是核心檢測手段之一。文中采用Western blot驗(yàn)證DC2.4/Hlx細(xì)胞株，提取DC2.4(未轉(zhuǎn)染)、DC2.4/EGFP(空質(zhì)粒)、DC2.4/mHlx(轉(zhuǎn)染)細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，用1:400稀釋的驢抗小鼠HLX1抗體孵育，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗驢IgG為二抗，ECL顯色檢測。結(jié)果顯示DC2.4/mHlx細(xì)胞中Hlx蛋白條帶(約51kD)灰度值顯著高于對照組，證實(shí)Hlx在該細(xì)胞株中穩(wěn)定高表達(dá)[2]。

參考文獻(xiàn)

[1]戴曉莉. 人HLX基因克隆表達(dá)及其功能的初步研究[D]. 江蘇:江蘇大學(xué),2009. DOI:10.7666/d.y1996133.

[2]許燕. Hlx對Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)及其與腦/脊髓損傷關(guān)系的研究[D]. 江蘇:江蘇大學(xué),2014. DOI:10.7666/d.Y2748283.