背景[1-6]
MMQ大鼠垂體瘤細(xì)胞源自大鼠垂體瘤，分泌泌乳素；表達功能性多巴胺受體。該細(xì)胞在免疫抑制的小鼠中不能成瘤，但在半固體培養(yǎng)基中可形成克隆。種屬來源:大鼠；組織來源: 垂體；疾病特征: 垂體瘤；細(xì)胞形態(tài): 上皮細(xì)胞樣；生長特性: 懸浮生長；培養(yǎng)基: F12:Ham＇s F12 Nutrient Mixture 2.5%FBS+15%HS；生長條件: 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%;溫度：37℃,傳代方法: 1：2至1：6，每周2次；凍存條件: 90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO，液氮儲存。
MMQ大鼠垂體瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[7][8]
MMQ大鼠垂體瘤細(xì)胞可用于大鼠垂體瘤細(xì)胞增殖與凋亡水平的研究：
Pei等在垂體腫瘤細(xì)胞中檢測到一個長約13 kb的mRNA呈高表達,而在正常垂體細(xì)胞中則無表達。體外研究顯示,將轉(zhuǎn)染PTTG的成纖維細(xì)胞種植于無胸腺裸鼠皮下,3周后形成腫瘤,故將這一基因定名為垂體瘤轉(zhuǎn)化基因。研究發(fā)現(xiàn),PTTG不僅表達于垂體瘤細(xì)胞,而且在細(xì)胞增殖活性高的正常組織有PTTG的高表達,如睪丸、胸腺和胚胎肝。
在正常結(jié)腸、肝臟、卵巢、垂體、胰腺、大腦、腎臟、末梢血白細(xì)胞等,PTTG只有弱表達甚至檢測不到,但在所有被研究的腫瘤細(xì)胞(垂體腫瘤、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢腫瘤、子宮腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、腎癌、白血病等)和腫瘤細(xì)胞系(淋巴細(xì)胞系、骨髓細(xì)胞系、間充質(zhì)細(xì)胞系、上皮細(xì)胞系等)中都有高表達。Zhang等用RT-PCR等方法檢測54例腦垂體腫瘤及其正常腦垂體組織后發(fā)現(xiàn),有46例腦垂體腫瘤PTTG mRNA含量高于對照組50%,其中23例分泌期型腦垂體腫瘤中,浸潤至蝶骨的腫瘤PTTGmRNA表達明顯高于病變局限在垂體窩的腫瘤。
目前,對于PTTG的研究表明,該基因廣泛參與了垂體瘤的發(fā)生發(fā)展的整個過程,對于垂體瘤的生成起到了關(guān)鍵作用。RNA干擾技術(shù)是目前新興且日益成熟的的基因沉默技術(shù),目前已被認(rèn)為是基因工程學(xué)領(lǐng)域的非常有效率的研究工具。用此技術(shù)可以高效穩(wěn)定特異地阻止目標(biāo)基因的表達,從而達到較為理想的沉默效果。目前,dsRNA,特別是siRNA已被廣泛而成功地應(yīng)用于諸如基因功能研究以及疾病病因與治療研究等多個領(lǐng)域。
在針對原癌基因設(shè)計的基因治療策略中,RNAi基因抑制效果確切,應(yīng)用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上,甚至可以達到基因敲除的效果其次,RNAi的抑制具有嚴(yán)格的序列特異性,治療的針對性強,應(yīng)用此技術(shù)能夠同時抑制多個不同基因而不致相互干擾;RNAi的作用具有級聯(lián)式放大效應(yīng)和高穿透性,更適合惡性腫瘤的實驗研究,RNAi技術(shù)在腫瘤的基因治療上具有光明的應(yīng)用前景。對多種腫瘤細(xì)胞系的研究也證實:腫瘤細(xì)胞中均存在著RNAi的機制,化學(xué)合成、質(zhì)粒/病毒或其他方式介導(dǎo)的RNAi可以有效的抑制內(nèi)源性RNA的表達。
參考文獻
[1]Pituitary Tumor Transforming Gene(PTTG)Stimulates Thyroid Cell Proliferation via a Vascular Endothelial Growth Factor/Kinase Insert Domain Receptor/Inhibitor of DNA Binding-3 Autocrine Pathway[J].D S.Kim,J A.Franklyn,K Boelaert,M C.Eggo,J C.Watkinson,C J.McCabe.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2006(11)
[2]PTTG overexpression is correlated with angiogenesis in human pituitary adenomas[J].Takeo Minematsu,Masanori Suzuki,Naoko Sanno,Susumu Takekoshi,Akira Teramoto,R.Yoshiyuki Osamura.Endocrine Pathology.2006(2)
[3]RNA silencing and genome regulation[J].Ricardo Almeida,Robin C.Allshire.Trends in Cell Biology.2005(5)
[4]Development of gene-specific double-stranded RNA drugs[J].Sailen Barik.Annals of Medicine.2004(7)
[5]Cancer cells as targets for lentivirus-mediated gene transfer and genetherapy[J].Riikka Pellinen,Tanja Hakkarainen,Tiina Wahlfors,Kirsi Tulim?ki,Anna Ketola,Anni Tenhunen,Tuula Salonen,Jarmo Wahlfors.International Journal of Oncology.2004(6)
[6]Inhibitory effects of anti-sense PTTG on malignant phenotype of human ovarian carcinoma cell line SK-OV-3[J].Chen Gang,Li Jing,Li Fujun,Li Xiao,Zhou Jianfeng,Lu Yunping,Ma Ding.Journal of Huazhong University of Science and Technology[Medical Sciences].2004(4)
[7]Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex[J].Cell.2003(2)
[8]牟成志.RNA干擾沉默PTTG基因?qū)Υ笫蟠贵w瘤細(xì)胞增殖與凋亡水平的影響[D].山東大學(xué),2008.