甲酚紫的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
甲酚紫又名甲酚青蓮，屬惡嗪類染料，甲酚紫具有較強(qiáng)的組織穿透能力與良好的生物相容性，常用作動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)細(xì)胞的染色劑。隨著激光技術(shù)的提出與應(yīng)用，甲酚紫、吖啶紅、羅丹明B、羅丹明6G、香豆素等有機(jī)激光染料也隨之發(fā)展起來;在這個(gè)過程中，甲酚紫的光學(xué)性質(zhì)得到了進(jìn)一步的研究。甲酚紫水溶液呈紫色，其最大吸收和發(fā)射波長分別為585 nm和625 nm，可避免生物體系中短波長背景熒光的干擾。此外，甲酚紫具有較高的熒光量子產(chǎn)率（量子產(chǎn)率=0.51）和良好的化學(xué)與光穩(wěn)定性，且光學(xué)性質(zhì)不受常見生物物質(zhì)的干擾。我們還考察了甲酚紫本身熒光強(qiáng)度隨溶液pH的變化情況。由圖2可見，甲酚紫在弱酸性溶液，如pH=4.5~5.5中具有強(qiáng)熒光;雖然在生理pH范圍（pH=7~8）內(nèi)熒光略有降低，但仍較強(qiáng)，且此熒光幾乎不受生理pH變化的影響。重要的是與試鹵靈熒光體的羥基取代反應(yīng)類似，甲酚紫9-位氨基的取代反應(yīng)通常也會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅或波長漂移，而取代基發(fā)生反應(yīng)脫去后，甲酚紫熒光母體被釋放出來，熒光也隨之恢復(fù)。利用這一特性，人們通過在9-位氨基上設(shè)置不同的識(shí)別單元，設(shè)計(jì)合成了一系列新的甲酚紫類打開型和比率型光學(xué)探針，并用于不同生物分子的檢測(cè)與熒光成像分析。此外，人們利用帶正電荷的甲酚紫及其衍生物與納米材料間的靜電吸附作用，發(fā)展了不同的納米光學(xué)探針，也獲得了良好的應(yīng)用。
圖1 甲酚紫(10 μmol/L)的熒光隨溶液pH的變化情況
（λex/λem=585/625 nm;20 mmol/L的不同pH磷酸鹽緩沖液）
在蛋白酶檢測(cè)中的應(yīng)用
甲酚紫類探針在蛋白酶活性檢測(cè)方面取得了顯著進(jìn)展。研究者通過在9-位氨基上引入不同酶的識(shí)別基團(tuán)，開發(fā)出一系列高選擇性的熒光探針。例如：硝基還原酶探針：基于硝基的熒光猝滅效應(yīng)，探針本身幾乎無熒光，與硝基還原酶反應(yīng)后釋放甲酚紫，熒光顯著增強(qiáng)，可用于缺氧細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)酶的成像。
谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶探針：通過磺酰胺基與甲酚紫連接，探針在酶作用后斷裂磺胺鍵，熒光恢復(fù)，適用于細(xì)胞提取物和活細(xì)胞中酶的檢測(cè)。
γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶探針：該探針對(duì)酶具有高度選擇性，熒光增強(qiáng)達(dá)500倍，已用于臨床血清樣品和癌細(xì)胞中酶的可視化檢測(cè)。
亮氨酸氨肽酶探針：具有超高靈敏度（檢出限0.42 ng/mL），可用于評(píng)估癌細(xì)胞對(duì)順鉑的抗藥性。
此外，針對(duì)成纖維活化蛋白、二肽基肽酶4、丙氨酸氨肽酶等酶的探針也相繼被開發(fā)，部分探針已實(shí)現(xiàn)多種酶的同步成像，為腫瘤研究和藥物篩選提供了新工具。
在小分子檢測(cè)中的應(yīng)用
甲酚紫類探針也可用于檢測(cè)小分子物質(zhì)。例如：
三聚氰胺檢測(cè)：基于其對(duì)甲酚紫共振熒光的抑制作用，建立了高靈敏度的檢測(cè)方法，適用于奶粉樣品分析。
硫化氫檢測(cè)：通過疊氮基的還原反應(yīng)，設(shè)計(jì)出比率型熒光探針，可用于活細(xì)胞和斑馬魚中H2S的成像分析，揭示其本底濃度低于0.1 μmol/L。
輔酶Q10檢測(cè)：利用磁性脂質(zhì)體與甲酚紫組裝，結(jié)合流動(dòng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)食品中輔酶Q10的高靈敏檢測(cè)。
在pH檢測(cè)中的應(yīng)用
甲酚紫對(duì)pH的敏感性也使其成為pH探針的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。其在中性條件下可穿過生物膜，在酸性細(xì)胞器（如溶酶體）中發(fā)生質(zhì)子化并積聚，適用于細(xì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。近年來，研究者還將甲酚紫與熒光黃共包覆于納米脂質(zhì)體中，構(gòu)建比率型pH探針，成功用于炎癥細(xì)胞模型中pH變化的檢測(cè)。
圖2 甲酚紫對(duì)pH的響應(yīng)
參考文獻(xiàn)
[1] 張昊琳, 胡一鳴, 馬會(huì)民. 甲酚紫類光學(xué)探針的研究進(jìn)展[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 33(05): 700-706.