背景及概述

葉酸雜質(zhì)C別名異葉酸（Isofolic Acid），CAS：47707-78-8，是歐洲藥典EP法定關(guān)鍵雜質(zhì)，分子式，分子量441.4，為葉酸蝶啶環(huán)位置異構(gòu)體，是葉酸原料藥質(zhì)控重點(diǎn)項(xiàng)目。葉酸母核為6-亞甲基取代蝶啶，雜質(zhì)C蝶啶環(huán)在7位連亞甲基氨基苯甲酰谷氨酸，骨架組成一致、空間異構(gòu)，理化性質(zhì)與葉酸高度近似，分離難度大。

理化特性

葉酸雜質(zhì)C為淡黃色類結(jié)晶粉末，水溶性偏弱，溶于稀堿溶液、碳酸氫鈉水溶液，難溶于醇、丙酮；紫外最大吸收280nm，酸堿穩(wěn)定性同葉酸，酸性加熱易水解斷裂酰胺鍵，強(qiáng)光照射加速蝶啶環(huán)氧化降解；pKa約3.52，極性略大于葉酸，HPLC出峰緊鄰主峰，是葉酸檢測(cè)最難分離雜質(zhì)之一。無(wú)葉酸生理活性，無(wú)法參與體內(nèi)一碳代謝，藥典嚴(yán)格限定原料藥限度≤0.5%（EP標(biāo)準(zhǔn)）。

質(zhì)控與應(yīng)用

藥典統(tǒng)一采用C18反相HPLC檢測(cè)葉酸雜質(zhì)C，緩沖鹽-甲醇梯度洗脫，波長(zhǎng)280nm，控制單雜限度[1]；雜質(zhì)C對(duì)照品專供藥企原料、片劑、注射液質(zhì)量檢驗(yàn)、方法學(xué)驗(yàn)證、藥典標(biāo)定。原料超標(biāo)需優(yōu)化蝶啶中間體精餾、縮合溫度控溫（35~40℃）減少異構(gòu)生成。葉酸雜質(zhì)C無(wú)藥用價(jià)值，僅作為雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是葉酸API國(guó)內(nèi)外申報(bào)必檢項(xiàng)目。

圖1 葉酸雜質(zhì)C質(zhì)控圖譜

制備與對(duì)照品合成

實(shí)驗(yàn)室制備葉酸雜質(zhì)C分兩條路線：①化學(xué)合成：以2-氨基-4-氧代-7-氯甲基蝶啶與對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸縮合，弱堿性室溫縮合，酸化析出粗品，制備型HPLC純化，得到≥98%對(duì)照品；②原料藥富集提純：葉酸粗品堿溶，制備色譜分離富集雜質(zhì)C餾分，濃縮酸化結(jié)晶精制，多用于藥典標(biāo)定對(duì)照品，產(chǎn)業(yè)化無(wú)量產(chǎn)價(jià)值，僅雜質(zhì)標(biāo)品小批量合成。

參考文獻(xiàn)

[1]魏煒.色質(zhì)聯(lián)用分析葉酸雜質(zhì)譜和未知?dú)埩羧軇?[J]浙江工業(yè)大學(xué).2016-10-01.