背景及概述^[1]

關(guān)節(jié)囊分為兩層，外層為纖維層，由致密結(jié)締組織構(gòu)成；內(nèi)層為滑膜，由薄層疏松結(jié)締組織構(gòu)成，有產(chǎn)生和吸收滑液的作用?；?nèi)富有血管、神經(jīng)，其游離面被覆1～4層滑膜細(xì)胞?；ぜ?xì)胞呈扁平或多邊形，細(xì)胞核為梭形、圓形或卵圓形。滑膜細(xì)胞呈疏松的上皮樣排列，無(wú)基膜。有些滑膜細(xì)胞的表面具有分支的突起，這些突起沿表面水平伸展，相鄰細(xì)胞的突起彼此呈指狀交叉，有的表面具有少數(shù)絲狀偽足。在滑膜細(xì)胞之間的間隙內(nèi)有少量結(jié)締組織基質(zhì)，細(xì)胞間隙的基質(zhì)與滑液接觸，進(jìn)行物質(zhì)交換。根據(jù)電鏡研究，滑膜細(xì)胞可分為A型和B型，以前者為多。A型細(xì)胞表面有絲狀偽足，胞質(zhì)內(nèi)有大型高爾基復(fù)合體、很多溶酶體、吞飲小泡和微絲等，但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)很少。

B型細(xì)胞內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體，而其它細(xì)胞器少。A型細(xì)胞類(lèi)似巨噬細(xì)胞，B型細(xì)胞類(lèi)似成纖維細(xì)胞，但這二型細(xì)胞可能是同一種細(xì)胞不同的功能狀態(tài)?；ぜ?xì)胞的功能是產(chǎn)生滑液的粘蛋白，并有吞噬作用，以A型細(xì)胞的吞噬作用更活躍。常用的原代大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)方法主要是組織塊培養(yǎng)法、酶消化法、機(jī)械分散法等。實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同方法分離、培養(yǎng)Wistar大鼠滑膜細(xì)胞，使用倒置相差顯微鏡觀察不同方法培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)，并創(chuàng)新的采用了人工貼壁培養(yǎng)方法，并將其與自然貼壁方法作比較，選出分離培養(yǎng)方法。

制備^[1]

滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)：將分離的滑膜組織用含青霉素200kU/L、鏈霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以減少污染機(jī)會(huì)；去掉脂肪組織，將16個(gè)滑膜組織樣本平均分為A、B兩份。將A份不加處理分為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八個(gè)樣品，將B份用手術(shù)剪剪碎后分為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八個(gè)樣品。分別采取4種不同方法進(jìn)行處理。

1）不加消化酶消化法：分別將A1、A2、B1、B2離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，加入100μL100%的FBS混勻，用移液槍吸出注入培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱烘干15min，再將A1、B1加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS吹打均勻，A2、B2用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。

2）加Ⅱ型膠原酶消化法：將A3、A4、B3、B4離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，加入1mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A3、B3加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A4、B4用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。

3）加胰蛋白酶消化法：將A5、A6、B5、B6離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A5、B5加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A6、B6用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。

4）先加Ⅱ型膠原酶消化法再加胰蛋白酶消化：將A7、A8、B7、B8離心洗滌2次(2500r/min，離心6min)，吸棄上清液，吸取膠原酶Ⅱ至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，觀察組織成絮狀后，取出培養(yǎng)瓶，仔細(xì)吹打使組織塊分散，將未黏附細(xì)胞移入離心管離心(2500r/min，離心6min)，棄上清液，再加D-Hank's液洗滌，離心，吸棄洗滌液，重復(fù)離心3次，吸取胰蛋白酶至離心管中，輕輕吹打使組織塊重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱消化，消化結(jié)束取出培養(yǎng)瓶，加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化，用移液槍吸出，移入離心管離心(2500r/min，離心6min)。棄上清液，放入培養(yǎng)瓶中，A7、B7加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS，吹打均勻；A8、B8用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁，再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。

5）結(jié)果：培養(yǎng)9d后，觀察各培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的成活個(gè)數(shù)和生長(zhǎng)狀況，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞得數(shù)為2.03×106，是所有培養(yǎng)方法中細(xì)胞的數(shù)最多的。細(xì)胞活力為95%，與組織剪碎加膠原酶Ⅱ消化后人工貼壁培養(yǎng)同為各種培養(yǎng)方法中細(xì)胞活力最強(qiáng)的，綜合考慮方法為組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)。

主要參考資料

[1] 中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)·十三組織學(xué)與胚胎學(xué)

[2] 四種不同處理方法體外培養(yǎng)大鼠滑膜細(xì)胞