背景及概述[1]
豆蔻明(cardamonin，CDN)，結構為2'，4'-二羥基-6'-甲氧基查爾酮，主抗血小板聚集、抗腫瘤、抗誘變、抗炎、抗氧化和抗菌等多種生物活性。大量研究表明，豆蔻明對炎癥介質前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-ɑ、白介素(IL)-1β和IL-6的抑制作用與抑制NF-κB信號通路有關。TLＲ4是NF-κB的上游調控基因，有關豆蔻明對TLＲ4/NF-κB信號通路的調節(jié)作用僅見于我們前期的研究報道：豆蔻明對小鼠結腸黏膜炎性損傷的保護作用，可能與下調結腸組織的TLＲ4表達、抑制NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶活性和減少炎癥介質釋放有關。
豆蔻明的提取方法目前主要有乙醇提取法、乙醚提取法、丙酮提取法、氯仿提取法等，采用硅膠柱層析。這些提取分離方法得到的小豆蔻明含量較低，得率低，提取時間長，一般作為化學成分研究實驗室少量制備方法。史道華等采用95％乙醇浸漬3天，以8倍量乙醇回流2次，每次2小時，減壓回收乙醇得600ml濃縮液，濃縮液制成水混懸液后用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取液減壓回收溶劑，濃縮后得340g浸膏，浸膏溶于適量丙酮，拌樣，用相當于固體5倍量的硅膠濕法裝柱，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫，收集各洗脫部分，與對照品在同一薄層板上點樣，分別以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(15∶4∶1)、三氯甲烷-甲醇(20∶1)展開，紫外燈(波長365nm)下觀察，合并于對照品相應位置出現(xiàn)暗斑的餾分，常壓濃縮得13g混晶。混晶再過硅膠柱，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯-丙酮系統(tǒng)，濃縮后得5g晶體。取100g凝膠用甲醇溶脹過夜，裝柱，晶體溶于甲醇后取20ml上柱，按每份3ml進行收集，薄層(TLC)分析并用標準品對照，合并相同餾分后濃縮，得橙黃色針狀晶體4.2g，該方法雖然比丙酮提取法有顯著提高，提取率為0.084％，但提取率仍然很低，提取時間長，有機溶劑萃取萃取率低、損失較大。
應用[2-3]
早在1948年就研究報道了山姜素等二氫黃酮類和查耳酮類化合物的殺蟲活性，結果表明豆蔻明等查耳酮的作用緩慢而持久。于1993年研究報道了姜科4種植物根莖的殺蟲成分，結果表明豆蔻明活性較弱。對38種泰國可食用和藥用植物的40份甲醇提取物抑制非洲淋巴瘤細胞病毒(EB病毒)誘導腫瘤形成的作用進行研究，發(fā)現(xiàn)Boesenbergiapardurata根莖中的豆蔻明是一個極具潛力的腫瘤形成抑制劑，他們于1994年在日本申請了專利，大量生產(chǎn)主含豆蔻明的食品和飲料。通過對小鼠角叉菜膠誘導產(chǎn)生跖部水腫的抑制作用來研究黃酮類化合物的口服抗炎活性，結果表明A環(huán)上的C5和C7位上的甲氧基、吡喃環(huán)B的存在是抗炎活性的必要結構特征，豆蔻明等查耳酮幾無抗炎活性。番荔枝科植物假鷹爪Desmoschinesis中豆蔻明對大多數(shù)細菌有顯著抑制作用。研究云南草蔻Alpiniablepharocalyx果實中8個化合物的抗血小板聚集活性，結果表明豆蔻明對花生四烯酸(AA)引起的血小板聚集有較強的抑制作用，對膠原(collagen)、二磷酸腺苷(ADP)和瑞斯托菌素(ristocetin)引起的血小板聚集有不同程度的抑制作用。
此外，豆蔻明對TLＲ4/MyD88/NF-κB/iNOS信號通路的調節(jié)作用。利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理RAW264.7細胞建立炎性細胞模型并分組：正常對照組（Vehicle組）、模型組（LPS組）和藥物處理組（LPS+CDN組）；CCK-8方法檢測細胞活力，Griess法檢測細胞培養(yǎng)上清一氧化氮（nitricoxide，NO）含量，RT-PCR檢測誘導型NO合成酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、單核細胞趨化蛋白-1（monocytechemotacticprotein1，MCP-1）、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-ɑ、白介素（interleukin，IL）-1β和IL-6的mRNA表達，Westernblot檢測iNOS、TLR4、髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）、核因子-κB（nuclearfactorκB，NF-κB）phosphorylated（p）-p65、inhibitorκBα（IκBα）和p-IκBα的蛋白表達。結果150μmol·L-1豆蔻明對RAW264.7細胞沒有毒性，但可以劑量依賴性抑制LPS誘導的NO分泌和iNOS、COX-2、MCP-1、TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達，25μmol·L-1豆蔻明可下調LPS誘導的iNOS、TLR4、MyD88、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表達及抑制IκBα降解。結論豆蔻明通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號通路從而抑制NO的產(chǎn)生。
制備[4]
一種提取率高、周期短、高純度的小豆蔻明的提取方法，具體包括以下步驟：
a.提取步驟：取適量草豆蔻種子，粉碎至20-60目，以冷滲、溫浸或回流提取法，將草豆蔻種子粉以溶劑提取1-3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏；
b.有機溶劑萃取步驟：將浸膏用石油醚萃取至萃取液近無色，棄去石油醚萃取液，保留剩余浸膏；
c.分離純化步驟：將剩余浸膏采用柱層析分離，用水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或它們的混合溶液洗脫，高效液相色譜監(jiān)測，收集含小豆蔻明的流出液，此流出液經(jīng)濃縮后用有機溶劑結晶即可獲得高純度小豆蔻明。
主要參考資料
[1] 豆蔻明對TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號通路的調節(jié)作用
[2] 比較研究山姜素和豆蔻明與人-γ球蛋白的相互作用
[3] 山姜素和豆蔻明的研究概況
[4] CN201010235806.0一種從草豆蔻中提取小豆蔻明的方法