他克莫司（結(jié)構(gòu)式見圖1）是一種強(qiáng)效的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑, 在分子水平，本品的作用是由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與之結(jié)合的蛋白FKBP12介導(dǎo)的。FKBP12使得本品進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并形成復(fù)合物，該復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性地與鈣調(diào)素特異性地結(jié)合并抑制鈣調(diào)素，后者介導(dǎo)T細(xì)胞內(nèi)-鈣依賴性抑制性信號(hào)傳遞系統(tǒng)，從而阻止一系列淋巴因子基因轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，他克莫是一強(qiáng)效的免疫抑制劑，可抑制細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的形成，移植排斥反應(yīng)主要是由后者引起。
他克莫司藥抑制T細(xì)胞活化及TH細(xì)胞依賴性的B細(xì)胞增殖，以及淋巴子的生成如白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素3及β-干擾素，以及白細(xì)胞介素-2受體的表達(dá)。他克莫司可抑制皮膚、心臟、腎、肝移植的排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)同種移植物的存活時(shí)間，已在嚙齒類動(dòng)物、犬、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類身上得到證實(shí)。上市以來已廣泛用于肝、腎和骨髓移植的急慢性排斥治療.
各國(guó)藥典及注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)均將他克莫司的雜質(zhì)控制納入強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)體系，其中《美國(guó)藥典》、《歐洲藥典》、《中國(guó)藥典》等主流藥典均對(duì)他克莫司的雜質(zhì)種類、限度及檢測(cè)方法作出了明確規(guī)定，涵蓋外觀性狀、有關(guān)物質(zhì)、含量、儲(chǔ)存條件等關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目。不同藥典在雜質(zhì)限度設(shè)定、檢測(cè)方法（如色譜柱選型、流動(dòng)相組成、檢測(cè)波長(zhǎng)）等方面存在差異，適配不同地區(qū)的藥品生產(chǎn)與監(jiān)管要求。本文列舉部分他克莫司標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下色譜檢測(cè)參數(shù)，如圖2所示。
他克莫司雜質(zhì)作為我司熱銷雜質(zhì)系列之一，為了更好的控制他克莫司雜質(zhì)的品質(zhì)，我司按照EP標(biāo)準(zhǔn)對(duì)他克莫司進(jìn)行檢測(cè)。本文針對(duì)EP標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)下色譜柱的選擇進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)分享。
圖2:他克莫司不同標(biāo)準(zhǔn)中色譜檢測(cè)參數(shù)匯總（有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)）
在對(duì)他克莫司進(jìn)行核磁及質(zhì)譜定性后，我司根據(jù)他克莫司EP標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)方法進(jìn)行HPLC液相分析。EP色譜條件采用了甲基叔丁基醚(MTBE)和乙腈的混合溶劑作為有機(jī)相，磷酸溶液為水相，在較高的色譜柱溫和流速條件下進(jìn)行洗脫。根據(jù)EP色譜條件可以看出典型的高疏水大環(huán)內(nèi)酯分析思路：
1.采用封端C18色譜柱并在60℃高溫條件下運(yùn)行，這可以有效改善傳質(zhì)效率并降低強(qiáng)保留帶來的拖尾；
2.流動(dòng)相中引入MTBE與乙腈的混合有機(jī)體系，顯著調(diào)節(jié)選擇性，有效拉開結(jié)構(gòu)相近雜質(zhì)的分離；同時(shí)配合磷酸強(qiáng)酸環(huán)境抑制硅醇基作用，優(yōu)化峰形與重復(fù)性；
3.較高流速(1.5 mL/min)進(jìn)一步縮短分析時(shí)間。
整體方法強(qiáng)調(diào)在復(fù)雜雜質(zhì)體系中的分離能力與穩(wěn)定性，體現(xiàn)了歐洲藥典在復(fù)雜天然產(chǎn)物類藥物質(zhì)量控制中“選擇性優(yōu)先”的技術(shù)路線。在色譜柱的選擇上，EP推薦了Luna C18(2)型號(hào)的色譜柱，該色譜柱信息如圖3及圖4所示：
但是如果藥典中推薦的色譜柱在實(shí)驗(yàn)室沒有現(xiàn)成的柱子或者基于其他原因需要進(jìn)行替換。那么如何選擇用一根不同品牌或不同系列的色譜柱，來替代方法中規(guī)定的原色譜柱呢？
查詢相關(guān)信息發(fā)現(xiàn)：Luna C18(2)為常規(guī)通用C18柱，具有超純硅膠基質(zhì)、高鍵合致密度和均勻度，形成的“疏水保護(hù)層”惰性強(qiáng)，能有效減少分析物與殘留硅醇基團(tuán)的作用，改善峰形。
基于此，本司選用5種不同品牌C18色譜柱在EP條件下進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，檢測(cè)情況如下圖6-圖9所示：
圖5:Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm）
圖6:Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）
觀察圖5及圖6，在他克莫司EP標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中，使用Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm)及Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）在40 min?附近的基線位置出現(xiàn)了明顯的倒峰，這一現(xiàn)象是對(duì)定量準(zhǔn)確性的直接干擾，將會(huì)帶來兩大風(fēng)險(xiǎn)：
基線漂移與積分誤差：倒峰導(dǎo)致基線在目標(biāo)峰洗脫區(qū)間發(fā)生不規(guī)則波動(dòng)，積分軟件可能誤將倒峰的谷值作為基線零點(diǎn)，從而低估目標(biāo)峰的峰面積，直接造成定量結(jié)果偏低。
雜質(zhì)峰誤判風(fēng)險(xiǎn)：若他克莫司部分降解雜質(zhì)或工藝殘留恰好出峰在40 min?附近區(qū)間，倒峰的負(fù)信號(hào)可能與微量雜質(zhì)的正信號(hào)疊加，掩蓋真實(shí)雜質(zhì)峰的存在，進(jìn)而影響對(duì)產(chǎn)品純度的準(zhǔn)確評(píng)估。
圖7：Luna Omega Polar C18 100A (4.6*150mm,5um)圖8：XBridge C18 (4.6*250mm,5μm)觀察圖7及圖8，在他克莫司EP標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中，使用Luna Omega Polar C18 100A(4.6*150mm,5um)與XBridge C18(4.6*250mm,5μm)實(shí)際檢測(cè)效果差異不大,均能夠滿足Ep檢測(cè)需求。由于Luna系列液相色譜柱的建議溫度上限不超過60°C，而Waters Xbridge C18柱在低pH條件下溫度上限可達(dá)80℃，考慮到色譜柱使用壽命。因此，在二者的選用上，XBridge C18?的耐高溫與耐酸特性更具優(yōu)勢(shì)，可減少色譜柱更換頻率，降低長(zhǎng)期使用成本。
圖9：WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)觀察圖9，在他克莫司EP標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中，WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)表現(xiàn)優(yōu)異。峰形尖銳對(duì)稱，無拖尾或前伸現(xiàn)象，對(duì)他克莫司的保留與分離能力出色，柱效較高。
圖11：WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)空白圖譜觀察圖10及圖11，Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm）、Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）、Luna Omega Polar C18 100A (4.6*150mm,5um)、XBridge C18 (4.6*250mm,5μm)四根色譜柱的空白基線響應(yīng)可達(dá)1000mAU-2500mAU，而WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)空白基線響應(yīng)可控至10mAU以下，基線全程平穩(wěn)無明顯漂移或噪聲，在目標(biāo)峰出峰前后未出現(xiàn)倒峰、雜峰等干擾信號(hào)，系統(tǒng)背景干擾極低，為準(zhǔn)確積分提供了可靠基礎(chǔ)。同時(shí)檢測(cè)人員可以更直觀的觀測(cè)到檢測(cè)結(jié)果。
他克莫司是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)中缺乏強(qiáng)共軛的發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)，它的主要紫外吸收來自于分子中的羰基(C=O)、羥基(-OH)以及孤立的雙鍵，這些基團(tuán)的吸收都處于末端吸收區(qū)域。因此，他克莫司的最大吸收波長(zhǎng)通常在 210 nm 至 220 nm 之間。
對(duì)于紫外檢測(cè)波長(zhǎng)在 190 nm ~ 220 nm 之間的區(qū)域,通?？梢允褂玫筒ㄩL(zhǎng)專用柱。在低波長(zhǎng)的樣品檢測(cè)時(shí)，各色譜柱廠商都會(huì)推出標(biāo)注low backgrounds（低背景）或相關(guān)表述的色譜柱系列，核心是填料硅膠基質(zhì)純化度高、鍵合相殘留低，在紫外低波長(zhǎng)下無額外吸收，避免基線漂移/干擾。
本文通過對(duì)Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm）、Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）、Luna Omega Polar C18 100A (4.6*150mm,5um)、XBridge C18 (4.6*250mm,5μm)及WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)五根色譜柱的選用對(duì)比，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)ondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)在他克莫司檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。因此，如果他克莫司檢測(cè)中需要進(jìn)行色譜柱篩選，建議可以優(yōu)先選擇WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)色譜柱進(jìn)行嘗試。
