?? 傳代前準(zhǔn)備
試劑與耗材：無菌PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、無菌離心管、移液管、培養(yǎng)皿、超凈工作臺、CO?培養(yǎng)箱。
細(xì)胞狀態(tài)確認(rèn)：在顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最佳，增殖能力強(qiáng)。
?? 具體操作步驟
棄去舊培養(yǎng)基：將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺內(nèi)用移液管吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，注意不要直接對準(zhǔn)細(xì)胞層吹吸，避免損傷細(xì)胞。
清洗細(xì)胞：加入適量無菌PBS緩沖液，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使P液充分接觸細(xì)胞層，清洗掉殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝廢物，重復(fù)清洗2-3次后吸去PBS。
消化細(xì)胞：加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，以剛好覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)皿放入CO?培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。期間可在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始皺縮、間隙增大時(shí)，即可終止消化。
終止消化：加入等量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁上脫落并形成細(xì)胞懸液，血清中的成分可中和胰蛋白酶的活性，避免過度消化。
離心收集細(xì)胞：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，離心完成后棄去上清液，底部的細(xì)胞團(tuán)即為待傳代的細(xì)胞。
重懸細(xì)胞：向離心管中加入適量新鮮的含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞均勻分散形成細(xì)胞懸液。
接種傳代：根據(jù)所需的傳代比例（通常為1:2至1:4），將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布。
培養(yǎng)細(xì)胞：將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)皿放入CO?培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況，適時(shí)更換培養(yǎng)基。
?? 注意事項(xiàng)
全程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免細(xì)菌、真菌等微生物污染細(xì)胞。
消化時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和消化液的活性靈活調(diào)整，避免消化不足導(dǎo)致細(xì)胞難以脫落，或消化過度損傷細(xì)胞。
傳代比例可根據(jù)細(xì)胞的生長速度進(jìn)行調(diào)整，生長較快的細(xì)胞可適當(dāng)提高傳代比例，生長較慢的細(xì)胞則降低傳代比例。