乳腺癌是全球女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，約占新增癌癥病例的 11.6%，死亡率達 6.9%，嚴重威脅女性健康。盡管早期診斷和治療技術不斷進步，但仍有部分患者會出現(xiàn)疾病進展和遠處轉移，其潛在分子機制尚未完全闡明。環(huán)狀RNA（circRNAs）作為一類具有閉合環(huán)狀結構的非編碼 RNA，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著miRNA海綿、結合 RNA 結合蛋白、編碼多肽等多種生物學功能，已成為腫瘤研究的熱點方向。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與乳腺癌細胞的 “癌 - 免疫細胞” 串擾在腫瘤進展中起到關鍵作用。近日，中國農業(yè)大學的研究團隊發(fā)表于《Oncogene》的一項研究“Circular RNA CLASP1 modulates the GLI1/SNAIL axis and enhances macrophage polarization in breast cancer”，深入探討了 circCLASP1 在乳腺癌中的作用及分子機制，為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶點和思路。

_{Figure 1. Graph abstract}

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circCLASP1 在乳腺癌組織和血清中高表達，具備診斷潛力

研究團隊通過重分析 GEO 數(shù)據集（GSE71651），篩選出在乳腺癌中差異表達顯著的 circRNAs，發(fā)現(xiàn) circCLASP1 是其中表達上調最為明顯的分子之一。為驗證這一結果，研究者檢測了65例乳腺癌組織、42 ?例癌旁組織、61 例乳腺癌患者血清及 10 例正常血清樣本中 circCLASP1 的表達水平，證實 circCLASP1 ?在乳腺癌組織和血清中均顯著高表達。此外，circCLASP1 的表達與淋巴結轉移、ki67 表達及腫瘤大小呈正相關，且其半衰期長于線性 ?CLASP1 mRNA，能抵抗 RNase R 消化，主要定位于細胞質中。這些結果表明，circCLASP1 具有作為乳腺癌診斷生物標志物的潛力。

_{Figure 2. 癌癥中circCLASP1的鑒定與表征}

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circCLASP1 促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

為明確 circCLASP1 的生物學功能，研究人員設計靶向其反向剪接位點的 shRNA，在乳腺癌細胞系中成功敲低 circCLASP1 表達。功能實驗顯示，敲低 ?circCLASP1 后，MDA-MB-231 和 MCF-7 細胞的增殖能力、集落形成能力顯著下降，ki67 ?陽性細胞比例減少，患者來源類器官（PDO）的生長速度和直徑也明顯降低。同時，Transwell 實驗證實，敲低 circCLASP1 ?能顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。細胞周期和凋亡分析顯示，敲低 circCLASP1 可導致細胞周期停滯，凋亡細胞數(shù)量增加，且 BAX ?蛋白水平升高、BCL2 蛋白水平降低。體內實驗進一步驗證，敲低 circCLASP1 的乳腺癌細胞在裸鼠體內形成的移植瘤重量顯著減輕。上述結果表明，circCLASP1 在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

_{Figure 3. CircCLASP1在BC細胞中作為致癌基因發(fā)揮作用}

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U2AF2 調控 circCLASP1 的生物合成，參與乳腺癌惡性表型調控

RNA 結合蛋白（RBPs）可通過結合 circRNA 的側翼序列調控其生物發(fā)生。研究通過整合 3 個 RBP 預測數(shù)據庫，篩選出可能參與 circCLASP1 生物發(fā)生的關鍵上游調控因子 PTBP1 和 U2AF2。功能獲得實驗顯示，過表達 ?U2AF2 能顯著增加 circCLASP1 的表達，而過表達 PTBP1 對 circCLASP1 表達無明顯影響。WB結果證實 U2AF2 ?在乳腺癌組織中高表達，且在淋巴結陽性和 ki67 陽性的乳腺癌患者中，U2AF2 高表達與總生存期縮短相關。相關性分析顯示，U2AF2 與 ?circCLASP1 的表達呈正相關。RIP實驗進一步證實，U2AF2 通過結合 circCLASP1 側翼序列的 “+112~+136” ?區(qū)域調控其生物發(fā)生。拯救實驗表明，過表達U2AF2 可增強乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而敲低 circCLASP1 能部分逆轉這一效應。

_{Figure 4. U2AF2介導circCLASP1的生物合成}

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circCLASP1 不通過海綿化 miRNA 或編碼多肽發(fā)揮作用

考慮到circRNA常通過miRNA 海綿機制調控功能，且circCLASP1 主要定位于細胞質，研究者推測其可能作為 miRNA 海綿調控乳腺癌進展。RIP 實驗顯示 circCLASP1 能與 AGO2 結合，通過生物信息學預測和篩選，確定 miR-15a-5p 為其潛在靶標。RNA ?pull-down 和雙熒光素酶報告實驗證實，circCLASP1 可與 miR-15a-5p ?直接結合。然而，拯救實驗表明，miR-15a-5p 過表達無法顯著抑制 circCLASP1 ?過表達介導的乳腺癌細胞增殖、集落形成及遷移侵襲。這些結果表明，circCLASP1 并非通過海綿化 miRNA 或編碼多肽發(fā)揮癌基因功能。

_{Figure 5. CircCLASP1促進乳腺癌進展而不作為微小RNA的海綿}

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circCLASP1 結合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化降解

為進一步探究 circCLASP1 的作用機制，研究人員通過 RNA pull-down 結合質譜分析，篩選出與 circCLASP1 相互作用的蛋白質，發(fā)現(xiàn)分子伴侶 CCT2 是其特異性結合蛋白。RIP 實驗驗證了 circCLASP1 與 CCT2 的相互作用，且 AlphaFold3 模擬顯示二者存在穩(wěn)定的結合結構。免疫共沉淀實驗表明，敲低 circCLASP1 會減弱 CCT2 與 GLI1 的相互作用，且 circCLASP1、CCT2 和 GLI1 形成復合物。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低 ?circCLASP1 不影響 GLI1 的 mRNA 水平，但會降低其蛋白穩(wěn)定性。CHNO?（CHX）追蹤實驗顯示，敲低 circCLASP1 ?會縮短 GLI1 的蛋白半衰期，而蛋白酶體抑制劑 MG132 可逆轉這一效應。泛素化實驗證實，敲低 circCLASP1 會增加 GLI1 ?的泛素化水平。在蛋白檢測過程中，研究使用了AtaGenix提供的 CDK4 抗體，為實驗結果的可靠性提供了有力支持。這些結果表明，circCLASP1 通過結合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化介導降解，從而穩(wěn)定 GLI1 蛋白。

_{Figure 6. CirCCLASP1結合到CCT2并調節(jié)GLI1的泛素介導降解}

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circCLASP1 通過GLI1/SNAIL軸調控乳腺癌進展

GLI1 作為轉錄因子，其核積累是發(fā)揮功能的關鍵。免疫印跡和核質分離實驗顯示，敲低 ?circCLASP1 會抑制 GLI1 的核積累。生存分析表明，GLI1 下游靶基因 SNAIL 高表達的乳腺癌患者總生存期顯著縮短，且 ?GLI1 與 SNAIL 在乳腺癌中呈正相關。實驗證實，敲低 circCLASP1 會顯著降低 SNAIL 的 mRNA 和蛋白水平，且 ?circCLASP1 與 SNAIL 在乳腺癌組織中表達呈正相關。過表達野生型或 miR-15a-5p 結合位點突變型 ?circCLASP1，均能增強乳腺癌細胞的增殖、集落形成及遷移侵襲能力，且不影響 CCT2 與 GLI1 的相互作用和 SNAIL ?的表達。這些結果表明，circCLASP1 通過 CCT2/GLI1/SNAIL 軸促進乳腺癌進展，且該過程不依賴于 miR-15a-5p。

_{Figure 7.CircCLASP1通過GLI1在轉錄水平上調控SNAIL的表達}

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circCLASP1 通過 SNAIL 調控巨噬細胞招募和極化，促進肺轉移

為探究 circCLASP1 對腫瘤微環(huán)境的影響，研究者通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，circCLASP1 ?低表達的乳腺癌組織中 CD68 陽性巨噬細胞數(shù)量顯著減少，而 CD3 陽性 T ?細胞數(shù)量無明顯差異。條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)實驗顯示，circCLASP1 過表達的乳腺癌細胞條件培養(yǎng)基可促進 THP-1 細胞向 M2 ?型巨噬細胞極化，而敲低 circCLASP1 則抑制這一過程。RT-qPCR 結果證實，circCLASP1 可調控乳腺癌細胞中 CCL2 和 ?CCL5 的表達，實時共培養(yǎng)實驗顯示，circCLASP1 過表達的乳腺癌細胞能顯著招募巨噬細胞，Transwell ?實驗進一步驗證了這一結果。體內實驗中，通過尾靜脈注射 4T1 細胞構建肺轉移模型，證實 circCLASP1 過表達可促進乳腺癌肺轉移，增加 ?Snail 表達和巨噬細胞招募，而敲低 Snail 能逆轉這些效應。這些結果表明，circCLASP1 通過 SNAIL 調控 CCL2 和 CCL5 表達，進而促進巨噬細胞招募和 M2 極化，加速乳腺癌轉移。

_{Figure 8. CircCLASP1增強巨噬細胞在BC細胞中的募集}

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本研究系統(tǒng)探討了 circCLASP1 在乳腺癌中的作用及分子機制，發(fā)現(xiàn) circCLASP1 在乳腺癌組織和血清中高表達，其表達水平與臨床病理特征相關，具備作為診斷生物標志物的潛力。功能上，circCLASP1 ?通過 U2AF2 介導的生物發(fā)生途徑產生，作為分子支架結合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化降解，促進 GLI1 核積累，進而上調 ?SNAIL 表達，通過 CCL2/CCL5 軸招募并極化巨噬細胞，最終促進乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及肺轉移。該研究揭示了 circCLASP1 ?在乳腺癌進展中的關鍵作用及調控網絡，為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶點。

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abinScience為本研究提供了anti-CDK4抗體（HY215014），蛋白水平的精準檢測為機制驗證提供了關鍵支撐，助力科研團隊清晰揭示 circCLASP1通過CCT2/GLI1/SNAIL軸調控乳腺癌進展的分子鏈條。