判斷豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是否污染，可以按?「快速肉眼初篩→鏡下形態(tài)確認(rèn)→特異性檢測(cè)驗(yàn)證」?的流程逐步排查，常見污染分為細(xì)菌、真菌、支原體、細(xì)胞系交叉污染四類，具體判斷方法如下：
一、第一步：快速肉眼初篩（最快1天可發(fā)現(xiàn)）
觀察培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板的外觀和培養(yǎng)基變化，這是最直觀的初篩方法：
?細(xì)菌污染?：培養(yǎng)基會(huì)快速變渾濁，通常培養(yǎng)1-2天就會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶能看到懸浮物，即使更換培養(yǎng)基渾濁也會(huì)很快再次出現(xiàn)；
?真菌污染?：培養(yǎng)3-5天后，培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的白色/淡黃色菌落漂浮物，霉菌污染還會(huì)形成絲狀菌落，逐漸擴(kuò)散變大；
若培養(yǎng)基澄清、無懸浮物、顏色無異常快速變化，可初步排除細(xì)菌和真菌污染。
二、第二步：倒置顯微鏡下形態(tài)確認(rèn)（100-200倍鏡檢即可）
三、第三步：特異性檢測(cè)驗(yàn)證（確認(rèn)隱形污染）
對(duì)于肉眼和鏡下都難發(fā)現(xiàn)的隱性污染，需要通過專門方法檢測(cè)：
?支原體污染（最常見的隱形污染）?：
快速法：用商品化支原體檢測(cè)試劑盒（PCR法或熒光染色法）檢測(cè)，PCR法靈敏度最高，能檢出低濃度隱形污染；熒光染色后若細(xì)胞核周圍出現(xiàn)亮綠色熒光，即為陽性污染；
培養(yǎng)法：將少量細(xì)胞培養(yǎng)液接種到支原體液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基渾濁即為陽性。
?細(xì)胞交叉污染?：如果懷疑細(xì)胞被其他細(xì)胞系污染，直接做?STR鑒定?即可，豬源細(xì)胞可通過種屬特異性引物PCR確認(rèn)是豬源細(xì)胞，避免人/鼠源細(xì)胞污染。
?病毒污染?：僅在需要無血清規(guī)?；囵B(yǎng)或臨床轉(zhuǎn)化研究時(shí)檢測(cè)，普通科研實(shí)驗(yàn)不需要常規(guī)排查。
四、關(guān)鍵判斷要點(diǎn)
原代分離pADSCs因?yàn)槿〔淖詣?dòng)物組織，最容易發(fā)生細(xì)菌/真菌污染，分離時(shí)嚴(yán)格消毒取材環(huán)節(jié)能大幅降低污染概率；
支原體污染會(huì)緩慢影響細(xì)胞增殖和分化能力，即使鏡下形態(tài)正常，長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞也建議每1-2個(gè)月定期檢測(cè)一次；
如果發(fā)現(xiàn)污染，需要立刻對(duì)培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)進(jìn)行全面消毒，丟棄污染細(xì)胞，避免污染其他正常細(xì)胞。