摘要：MSC來源外泌體在再生醫(yī)學(xué)、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和藥物遞送等方向受到關(guān)注，但外泌體從實驗室研究走向規(guī)模化生產(chǎn)時，仍面臨細(xì)胞擴增效率、收集介質(zhì)顆粒本底、下游純化損耗和質(zhì)量屬性一致性等問題。培養(yǎng)基體系不僅影響MSC細(xì)胞狀態(tài)，也會影響EV收集效率、雜質(zhì)背景和后續(xù)DSP工藝負(fù)擔(dān)。本文圍繞MSC-EV生產(chǎn)中的上游擴增、EV收集、3D生物反應(yīng)器放大、TFF純化和質(zhì)量分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，梳理培養(yǎng)基與工藝選擇的技術(shù)邏輯。

關(guān)鍵詞：MSC外泌體；細(xì)胞外囊泡；EV培養(yǎng)基；外泌體收集培養(yǎng)基；3D生物反應(yīng)器；TFF純化；RoosterBio；RoosterCollect-EV；AgentV-DSP

為什么MSC外泌體生產(chǎn)不能只看“顆粒數(shù)”

在MSC外泌體研究中，顆粒數(shù)通常是最直觀的檢測指標(biāo)之一。很多實驗會通過納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(Nanoparticle Tracking Analysis， NTA)等方法觀察顆粒濃度變化，并據(jù)此判斷外泌體產(chǎn)量是否提高。但在真正的工藝開發(fā)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，只看顆粒數(shù)是不夠的。EV樣品中可能同時存在外泌體、微囊泡、蛋白聚集物、培養(yǎng)基背景顆粒、細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。如果上游培養(yǎng)體系本身顆粒本底較高，即使檢測到較高的顆粒濃度，也不一定代表目標(biāo)EV產(chǎn)物真正增加。

圖1. 納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）散射模式與熒光工作原理；激光照射懸浮顆粒，高靈敏度相機捕捉顆粒布朗運動軌跡，通過斯托克斯-愛因斯坦方程計算出流體力學(xué)粒徑；納米顆粒跟蹤分析技術(shù)分為兩種檢測模式，基于細(xì)胞外囊泡散射光信號檢測，熒光標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的熒光發(fā)射信號檢測^【1】

因此，MSC-EV生產(chǎn)需要同時關(guān)注幾個問題：細(xì)胞在擴增階段是否保持穩(wěn)定狀態(tài)，EV收集階段是否引入過多外源顆粒和雜蛋白，下游純化過程中是否出現(xiàn)明顯損耗，最終產(chǎn)物是否保持較好的身份標(biāo)志物、粒徑分布和功能相關(guān)指標(biāo)。培養(yǎng)基的作用也不應(yīng)只理解為“維持細(xì)胞生長”，而應(yīng)放在整個EV制造流程中來看。

上游擴增：穩(wěn)定的MSC狀態(tài)是EV生產(chǎn)的基礎(chǔ)

MSC來源外泌體的質(zhì)量與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞密度、代次、組織來源、供體差異、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間和氧環(huán)境等因素，都可能影響MSC分泌EV的數(shù)量和質(zhì)量。在早期研究階段，實驗室往往更關(guān)注細(xì)胞是否能夠正常貼壁、擴增和維持表型；但進入工藝放大后，細(xì)胞擴增效率、批次一致性和放大可重復(fù)性會變得更加關(guān)鍵。

傳統(tǒng)MSC擴增體系常依賴血清或成分復(fù)雜的補充物，這類體系在研究階段使用方便，但在轉(zhuǎn)化應(yīng)用中可能帶來批次差異、動物源成分風(fēng)險和下游雜質(zhì)干擾。相比之下，面向工藝開發(fā)的MSC擴增培養(yǎng)基通常更強調(diào)成分明確、可放大、可轉(zhuǎn)化和質(zhì)量文件支持。對于計劃推進外泌體藥物或MSC-EV相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的團隊來說，上游擴增體系越早標(biāo)準(zhǔn)化，后續(xù)工藝變更和質(zhì)量比較的壓力就越小。

RoosterBio的MSC生物制造體系中，RoosterNourish系列培養(yǎng)基和RoosterReplenish補料系統(tǒng)主要服務(wù)于MSC擴增和3D生物反應(yīng)器放大。對于研發(fā)團隊而言，這類體系的技術(shù)價值不只是“讓細(xì)胞長得更多”，而是幫助建立從2D培養(yǎng)到3D放大的連續(xù)工藝框架。

EV收集階段：低顆粒本底培養(yǎng)基的重要性

EV收集培養(yǎng)基是MSC外泌體生產(chǎn)中容易被低估的環(huán)節(jié)。很多實驗在收集外泌體時，會將細(xì)胞從擴增培養(yǎng)基切換到無血清或低血清培養(yǎng)體系，以減少外源囊泡和血清蛋白干擾。但如果收集培養(yǎng)基本身存在較高顆粒背景，或者含有復(fù)雜蛋白成分，后續(xù)檢測和純化就會受到影響。

理想的EV收集培養(yǎng)基通常需要具備幾個特點。第一，顆粒本底較低，盡量減少非細(xì)胞來源顆粒對EV定量的干擾。第二，成分相對明確，便于后續(xù)質(zhì)量控制和工藝放大。第三，能夠在一定收集窗口內(nèi)維持細(xì)胞健康，避免因營養(yǎng)不足或細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致EV組成發(fā)生明顯變化。第四，適配2D培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠、微載體體系或3D生物反應(yīng)器等不同生產(chǎn)模式。

RoosterCollect-EV和RoosterCollect-EV-CC就屬于圍繞EV收集階段設(shè)計的培養(yǎng)基體系。相比單純使用常規(guī)無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，低顆粒、化學(xué)成分限定、無蛋白或低雜質(zhì)背景的EV收集培養(yǎng)基，更適合用于MSC-EV工藝開發(fā)和后續(xù)放大研究。

從2D到3D：工藝放大的核心不是簡單擴大體積

MSC外泌體生產(chǎn)從2D培養(yǎng)轉(zhuǎn)向3D生物反應(yīng)器，并不是把培養(yǎng)面積或培養(yǎng)體積簡單放大。如圖1所示，2D培養(yǎng)體系中，細(xì)胞主要依賴培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠或多層培養(yǎng)容器進行貼壁擴增；而3D生物反應(yīng)器通常涉及微載體、攪拌、溶氧、pH、剪切力、補料策略和收集窗口等多種變量。任何一個變量變化，都可能影響MSC細(xì)胞狀態(tài)和EV分泌特征。

圖2. 在2D培養(yǎng)條件下MSCs外泌體生產(chǎn)流程概述^【2】

3D生物反應(yīng)器的優(yōu)勢在于單位空間內(nèi)可獲得更高的細(xì)胞生產(chǎn)能力，也更適合封閉化、自動化和規(guī)?；a(chǎn)。但同時，3D體系對培養(yǎng)基和補料策略提出了更高要求。培養(yǎng)基需要支持細(xì)胞在微載體上的黏附、生長和維持狀態(tài)，補料體系需要在不頻繁換液的情況下維持營養(yǎng)供給，并減少人工操作帶來的污染風(fēng)險和批次波動。

對于MSC-EV生產(chǎn)來說，3D放大的價值不僅體現(xiàn)在細(xì)胞數(shù)增加，也體現(xiàn)在EV生產(chǎn)流程更容易形成標(biāo)準(zhǔn)化工藝。例如，上游使用適合MSC擴增的培養(yǎng)基與補料體系，細(xì)胞達到目標(biāo)狀態(tài)后切換到低顆粒EV收集培養(yǎng)基，再結(jié)合連續(xù)或分段收集策略，可以幫助研發(fā)團隊更系統(tǒng)地評估EV產(chǎn)量、粒徑分布、標(biāo)志物和功能相關(guān)指標(biāo)。

下游純化：EV損耗往往發(fā)生在看不見的界面上

外泌體生產(chǎn)的另一個難點是下游純化。即使上游獲得了較高濃度的條件培養(yǎng)液，EV在澄清、濃縮、TFF、層析或過濾過程中也可能出現(xiàn)明顯損失。造成損耗的原因包括濾膜堵塞、管路或耗材表面吸附、剪切力影響、樣品黏度變化以及雜蛋白和細(xì)胞碎片帶來的過濾負(fù)擔(dān)。

在TFF或色譜體系中，EV顆粒可能發(fā)生非特異性吸附，導(dǎo)致最終回收率低于預(yù)期。對于小規(guī)模研究來說，這種損耗可能只是影響一次實驗結(jié)果；但對于規(guī)?；a(chǎn)來說，下游回收率會直接影響單位劑量成本、批次產(chǎn)量和工藝可行性。因此，MSC-EV工藝開發(fā)不能只優(yōu)化上游產(chǎn)量，還需要同時優(yōu)化DSP流程。

AgentV-DSP這類下游處理試劑的技術(shù)邏輯，主要是圍繞減少EV在過濾和純化過程中的損失展開。它可以作為DSP流程中的輔助工具，用于改善濾膜堵塞、提高顆?；厥章?，并幫助降低下游步驟中的非特異性損耗。對于正在從實驗室純化流程轉(zhuǎn)向可放大DSP流程的團隊來說，這類工具的價值在于讓“上游產(chǎn)出來的EV”盡可能在下游被保留下來。

質(zhì)量屬性：MSC-EV工藝開發(fā)需要建立多維評價體系

MSC-EV不是單一化學(xué)小分子，也不是結(jié)構(gòu)完全一致的重組蛋白。它是一類復(fù)雜的生物顆粒，來源于細(xì)胞分泌過程，受到組織來源、供體差異、培養(yǎng)條件、收集時間和純化方法等多因素影響。因此，MSC-EV工藝開發(fā)需要建立多維評價體系，而不是只依賴單一指標(biāo)。

常見的評價維度包括顆粒濃度、粒徑分布、蛋白含量、顆粒/蛋白比、形態(tài)學(xué)觀察、CD9/CD63/CD81等EV身份標(biāo)志物、細(xì)胞來源標(biāo)志物，以及與作用機制相關(guān)的功能指標(biāo)。近年來，CD73等功能相關(guān)指標(biāo)也逐漸受到關(guān)注，因為它不僅可以作為MSC-EV特征分析的一部分，也可能與免疫調(diào)節(jié)、腺苷通路和相關(guān)生物學(xué)功能有關(guān)。

這也意味著，培養(yǎng)基和工藝選擇最終都需要回到質(zhì)量屬性上驗證。一個培養(yǎng)基體系如果能提高顆粒數(shù)，但同時帶來較高雜質(zhì)背景或改變關(guān)鍵質(zhì)量屬性，并不一定適合后續(xù)轉(zhuǎn)化。相反，真正適合規(guī)?；_發(fā)的體系，應(yīng)當(dāng)在產(chǎn)量、純度、回收率、批次一致性和質(zhì)量屬性之間取得平衡。

RoosterBio培養(yǎng)基體系在MSC-EV工藝中的應(yīng)用思路

如果把RoosterBio相關(guān)產(chǎn)品放在完整工藝鏈條中理解，可以看到它并不是單一培養(yǎng)基產(chǎn)品，而是圍繞MSC擴增、EV收集和DSP回收形成的流程化工具組合。

在上游擴增階段，RoosterNourish系列MSC培養(yǎng)基可用于支持MSC細(xì)胞擴增，RoosterReplenish補料體系則更適合與3D生物反應(yīng)器放大流程結(jié)合。在EV收集階段，RoosterCollect-EV和RoosterCollect-EV-CC提供低顆粒、化學(xué)成分限定的EV收集環(huán)境，有助于降低培養(yǎng)基本底對EV定量和下游純化的干擾。在下游處理階段，AgentV-DSP可用于減少純化過程中的顆粒損耗，幫助提升DSP回收效率。

從技術(shù)寫作角度看，RoosterBio培養(yǎng)基體系更適合放在“MSC-EV規(guī)?；a(chǎn)流程”中介紹，而不是單獨寫成產(chǎn)品賣點。因為MSC-EV生產(chǎn)真正需要解決的是一整套工藝問題：如何穩(wěn)定擴增MSC，如何獲得低雜質(zhì)背景的EV條件培養(yǎng)液，如何從2D過渡到3D生物反應(yīng)器，如何減少DSP損耗，以及如何維持最終EV產(chǎn)物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

圖3. RoosterBio培養(yǎng)基體系支撐的MSC-EV全規(guī)?；a(chǎn)流程示意圖。上游：采用 RoosterNourish 擴增培養(yǎng)基 + RoosterReplenish 補料體系完成2D靜態(tài)/3D微載體生物反應(yīng)器 MSC 擴增；更換低顆粒 RoosterCollect-EV 收集培養(yǎng)基收獲 EV 上清；下游 DSP：上清澄清、AgentV-DSP 輔助 TFF 濃縮以降低顆粒非特異性吸附損耗，最終 EV制劑與多維度質(zhì)量檢測^【3】。

小結(jié)

MSC外泌體的規(guī)?；a(chǎn)不是單個環(huán)節(jié)的優(yōu)化，而是上游擴增、EV收集、3D放大、下游純化和質(zhì)量分析共同決定的結(jié)果。培養(yǎng)基體系在其中承擔(dān)了非常關(guān)鍵的角色：它既影響MSC細(xì)胞狀態(tài)，也影響EV收集背景、產(chǎn)物純化難度和最終質(zhì)量屬性。對于正在推進MSC-EV研究、工藝開發(fā)或臨床前轉(zhuǎn)化的團隊而言，選擇培養(yǎng)基時不應(yīng)只看短期產(chǎn)量，還應(yīng)關(guān)注成分明確性、低顆粒本底、放大兼容性、下游工藝適配性和質(zhì)量文件支持。

RoosterBio圍繞MSC和外泌體生物制造建立的培養(yǎng)基與工藝工具，為MSC-EV從研究階段走向規(guī)?；_發(fā)提供了一種可參考的路徑。實際應(yīng)用中，仍需結(jié)合細(xì)胞來源、培養(yǎng)模式、目標(biāo)產(chǎn)物、檢測方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行小規(guī)模驗證和工藝優(yōu)化。

FAQ

MSC外泌體生產(chǎn)為什么需要專用EV收集培養(yǎng)基？

專用EV收集培養(yǎng)基通常更關(guān)注低顆粒本底、低雜質(zhì)背景和收集階段細(xì)胞健康狀態(tài)。相比普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或復(fù)雜含血清體系，低顆粒、化學(xué)成分限定的EV收集培養(yǎng)基更有利于后續(xù)EV定量、純化和質(zhì)量分析。

3D生物反應(yīng)器一定比2D培養(yǎng)更適合MSC-EV生產(chǎn)嗎？

不一定。3D生物反應(yīng)器更適合規(guī)模化、封閉化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，但工藝復(fù)雜度也更高。早期研究可以使用2D體系建立基本參數(shù)，隨后再根據(jù)產(chǎn)量需求、質(zhì)量屬性和放大目標(biāo)評估是否轉(zhuǎn)向3D生物反應(yīng)器。

EV生產(chǎn)中為什么下游純化會造成大量損耗？

EV顆粒在TFF、過濾、層析和管路轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生非特異性吸附，也可能受到濾膜堵塞、雜質(zhì)負(fù)擔(dān)和工藝剪切等因素影響。下游損耗會直接影響最終回收率和單位產(chǎn)物成本，因此DSP優(yōu)化是EV規(guī)?；a(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。

RoosterCollect-EV-CC適合什么類型的應(yīng)用？

RoosterCollect-EV-CC更適合對低顆粒本底、化學(xué)成分限定、cGMP生產(chǎn)和工藝轉(zhuǎn)化有要求的EV收集場景，可用于MSC外泌體、細(xì)胞分泌組和EV相關(guān)工藝開發(fā)。具體應(yīng)用仍需要根據(jù)細(xì)胞類型、培養(yǎng)體系和收集窗口進行驗證。

AgentV-DSP在外泌體工藝中解決什么問題？

AgentV-DSP主要面向EV下游純化過程中的回收率問題，可用于減少過濾和純化過程中的顆粒損耗。它更適合作為DSP流程優(yōu)化工具，而不是替代上游培養(yǎng)基或EV收集培養(yǎng)基。

參考文獻

1. Kowkabany, G.; Bao, Y. Nanoparticle Tracking Analysis: An Effective Tool to Characterize Extracellular Vesicles. Molecules 2024, 29, 4672. https://doi.org/10.3390/ molecules29194672

2. RoosterBio Biomanufacturing, Quality & Regulatory. Critical Process Parameters in Primary Cell Manufacturing: Why & How They Matter for MSCs or Human Dermal Fibroblasts[EB/OL]. (2026-04-13)[2026-06-24]. https://www.roosterbio.com/blog/critical-process-parameters-in-primary-cell-manufacturing-why-how-they-matter-for-mscs-or-human-dermal-fibroblasts/.

3. RoosterBio, Repligen. Development of Manufacturing Therapeutic Platform for EVs[Poster/OL]. 2023[2026-06-24]. https://info.roosterbio.com/hubfs/Posters/Poster_2023_RoosterBio-Repligen_Development-of-Manufacturing-Therapeutic-Platform-for-EVs_v3.pdf.

本文基于RoosterBio公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實驗參考等。上海曼博生物可提供RoosterBio RoosterNourish系列MSC培養(yǎng)基、RoosterReplenish補料體系、RoosterCollect-EV、RoosterCollect-EV-CC、AgentV-DSP、MSC外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基、EV收集培養(yǎng)基、3D生物反應(yīng)器放大及TFF純化相關(guān)產(chǎn)品與技術(shù)支持，助力MSC-EV規(guī)模化生產(chǎn)、外泌體工藝開發(fā)、下游回收率優(yōu)化與質(zhì)量屬性分析。

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