關(guān)鍵詞：iPSC、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、iPSC 規(guī)模化接種、生物反應(yīng)器、PBS 垂直輪生物反應(yīng)器、PBS Mini 生物反應(yīng)器、iPSC 聚集體、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）、3D 聚集體培養(yǎng)、細(xì)胞傳代
摘要：本文拆解 PBS Mini 反應(yīng)器中 iPSC 3D 聚集體的標(biāo)準(zhǔn)化接種工藝，提供可落地操作方案，助力 iPSC 規(guī)模化培養(yǎng)工藝優(yōu)化。
1. 在接種到 3D 培養(yǎng)之前，先將細(xì)胞在 2D 種子培養(yǎng)體系中擴(kuò)增，或直接將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 3D 培養(yǎng)。
2. 培養(yǎng)基、試劑及 2D 培養(yǎng)參數(shù)應(yīng)根據(jù)您的細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
3. 在轉(zhuǎn)入 3D 懸浮培養(yǎng)前，您的 2D 種子培養(yǎng)體系須具備以下特點(diǎn)：特性明確、重復(fù)性和穩(wěn)定性
摘要：本文聚焦細(xì)胞治療臨床轉(zhuǎn)化中 iPSC 規(guī)?；?3D 培養(yǎng)的核心瓶頸，基于 PBS Biotech 廠家資料及數(shù)百個(gè)客戶實(shí)際應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)拆解了 PBS Mini 垂直輪生物反應(yīng)器中 iPSC 3D 聚集體培養(yǎng)的接種關(guān)鍵技術(shù)。文章闡明了單細(xì)胞傳代作為 3D 培養(yǎng)黃金標(biāo)準(zhǔn)的必要性，詳細(xì)介紹了培養(yǎng)基預(yù)平衡、質(zhì)量檢測、ROCK 抑制劑添加的接種前三步法，以及標(biāo)準(zhǔn)化接種密度、濃縮接種液制備和操作規(guī)范，并給出了不同場景的工具使用指南。本文為研究者提供了可復(fù)制、可放大的 iPSC 3D 培養(yǎng)接種方案，助力 iPSC 細(xì)胞治療工藝的標(biāo)準(zhǔn)化與臨床轉(zhuǎn)化。
在細(xì)胞治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的關(guān)鍵階段，iPSC 多能干細(xì)胞的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化 3D 培養(yǎng)已成為行業(yè)公認(rèn)的核心瓶頸。如何獲得大小均一、活力穩(wěn)定、可重復(fù)擴(kuò)增的細(xì)胞聚集體？如何實(shí)現(xiàn)從小試到中試的無縫工藝放大？如何降低每批次的生產(chǎn)成本？
作為 PBS 垂直輪生物反應(yīng)器 的核心技術(shù)合作伙伴，曼博生物致力于為中國區(qū)生物制藥研究者提供從工藝開發(fā)到規(guī)模化生產(chǎn)的技術(shù)支持方案?；?PBS Biotech 近期發(fā)布的資料及數(shù)百個(gè)客戶的實(shí)際應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，我們繼續(xù)為大家拆解 iPSC 3D 培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)-接種，幫你避開不必要的坑。
一、為什么單細(xì)胞傳代是 3D 培養(yǎng)的生命線？
很多研發(fā)人員在 iPSC 3D 培養(yǎng)中遇到的一個(gè)問題就是：聚集體大小不均、擴(kuò)增倍數(shù)低、批次間差異大。大概率，傳代流程需要優(yōu)化。
無酶解離試劑、細(xì)胞刮等團(tuán)塊傳代方法存在不可逾越的短板：
? 無法獲得單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差高達(dá) 30%以上
? 聚集體大小隨機(jī)分布，分化同步性差
? 無法實(shí)現(xiàn)工藝放大，從 T 瓶到反應(yīng)器的參數(shù)轉(zhuǎn)移幾乎不可能
?單細(xì)胞傳代：PBS 體系的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)
圖 1.單細(xì)胞傳代示意圖
PBS Biotech 經(jīng)過全球數(shù)十家頭部細(xì)胞治療企業(yè)驗(yàn)證，Accutase 酶解單細(xì)胞傳代法是 iPSC 3D 培養(yǎng)的可放大方案：
? 標(biāo)準(zhǔn)化酶解條件：推薦酶體積與培養(yǎng)面積比為 0.08 mL/cm2，2D 培養(yǎng)瓶中酶解時(shí)間控制在 7-10 分鐘
? 細(xì)胞質(zhì)量控制：酶解后單細(xì)胞率盡可能≥88%（即≥5 個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊占比≤12%），細(xì)胞活力≥90%
圖 2.種子細(xì)胞解離，單細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)示例。圖中 NC-200 應(yīng)用顯示，12%的細(xì)胞形成≥5 個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊
? 核心優(yōu)勢：
?細(xì)胞計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確，工藝可追溯性強(qiáng)
?產(chǎn)生更多更小的初始聚集體
?更容易放大
?產(chǎn)生更均一的聚集體尺寸大小
? 這些因素共同作用，使流程更加順暢且保障效率，細(xì)胞潛在擴(kuò)增倍數(shù)更高，并能更好地控制聚集體的形狀和大小。
二、準(zhǔn)備 PBS Mini 進(jìn)行接種
PBS Mini 接種前標(biāo)準(zhǔn)化三步法
1.培養(yǎng)基預(yù)平衡（提前 12-24 小時(shí)）
? 加入 95%工作體積的無 ROCK 抑制劑的完全培養(yǎng)基
? 0.1L 容器：95mL；0.5L 容器：475mL
? 置于培養(yǎng)箱中，設(shè)置目標(biāo)攪拌轉(zhuǎn)速（推薦 40rpm）過夜平衡
? 培養(yǎng)箱參數(shù)：37℃，5%CO?，相對濕度≥90%
圖 3.培養(yǎng)基預(yù)平衡示意圖
2.培養(yǎng)基質(zhì)量檢測（接種前必做）
轉(zhuǎn)移 3-5mL 培養(yǎng)基至生物安全柜，檢測并分析以下關(guān)鍵參數(shù)：
圖 4.接種前培養(yǎng)基質(zhì)量檢測與記錄
3.ROCK 抑制劑添加
? 按最終工作濃度 10μM 計(jì)算所需 ROCKi 體積
? 與少量新鮮培養(yǎng)基混合后無菌過濾
? 加入反應(yīng)器中，使總體積恢復(fù)至 95%工作體積
圖 5.Rocki 使用推薦操作流程
關(guān)鍵提醒：ROCKi 必須在接種前 30 分鐘內(nèi)加入，過早加入會(huì)導(dǎo)致藥效下降，影響單細(xì)胞存活。
三、接種：決定聚集體均一性的核心環(huán)節(jié)
接種密度和接種方法直接決定了后續(xù)聚集體的大小和生長狀態(tài)，PBS 體系經(jīng)過優(yōu)化，形成了一套可復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)化接種流程。
1.接種密度參數(shù)
PBS Mini 反應(yīng)器中，iPSC 3D 培養(yǎng)的推薦接種密度為 20,000 活細(xì)胞/mL（針對不同工藝需求，通常在 2e4-1e5 間優(yōu)化），這是經(jīng)過全球數(shù)百個(gè)項(xiàng)目驗(yàn)證的較優(yōu)值：
? 過低：聚集體形成困難，細(xì)胞凋亡增加
? 過高：聚集體過大，中心壞死，分化效率下降
2.濃縮接種液制備
接種密度（Inoculation density）：每毫升培養(yǎng)物中所引入的細(xì)胞數(shù)量；
接種物（Inoculum）：用于接種至培養(yǎng)體系的濃縮細(xì)胞懸液。
Working volume
Volume of media to pre-batch in the vessel（95% of working volume）
Inoculum density
Volume of inoculum to add to each pre-batched vessel（5% of working volume）
Inoculation density
PBS-0.1
100 mL
95 mL
400,000 viable cells/mL
5 mL
20,000 viable cells/mL
PBS-0.5
500 mL
475 mL
400,000 viable cells/mL
25 mL
20,000 viable cells/mL
圖 6（以上表格）.接種液體積與體系體積比例示意圖
? 制備 400,000 活細(xì)胞/mL 的濃縮接種液
? 接種體積為總工作體積的 5%
????? 0.1L 罐：加入 5mL 接種液
????? 0.5L 罐：加入 25mL 接種液
? 計(jì)算公式：C?V?=C?V?（務(wù)必多制備 10-20%的接種液，以補(bǔ)償移液損失）
3.標(biāo)準(zhǔn)化接種操作
1. 將反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至生物安全柜
2. 充分混勻接種液（每次接種前都要重新混勻）
3. 使用血清移液管緩慢加入接種液，沖洗移液管一次
4. 立即將反應(yīng)器放回培養(yǎng)箱，啟動(dòng)攪拌
圖 7.接種操作示意圖
避坑指南：不要使用微量移液器處理接種液！微量移液器的小口徑會(huì)產(chǎn)生較高的剪切力，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降 15-20%。
四、接種和混合 tips
PBS 垂直輪反應(yīng)器之所以成為 iPSC 3D 培養(yǎng)的常用體系，核心在于其獨(dú)特的低剪切、高均一性混合特性。但要充分發(fā)揮這一優(yōu)勢，建議掌握正確的混合方法。
不同場景的工具選擇指南
圖 8.不同場景的工具選擇
血清移液管
細(xì)胞復(fù)蘇；2D/3D 培養(yǎng)的細(xì)胞傳代；輕柔處理細(xì)胞聚集體（避免變形損傷）；從 Mini 反應(yīng)器中取樣
微量移液器
細(xì)胞計(jì)數(shù)前的細(xì)胞聚集體解離操作
渦旋振蕩器
細(xì)胞計(jì)數(shù)前，快速充分混勻細(xì)胞計(jì)數(shù)樣品
表 2. 不同場景的接種工具選擇
PBS Mini 接種與混合的三大黃金法則
1. 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移前必須充分溫和混勻
2. 同一實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)器使用同一批接種液
3. 接種后 2 小時(shí)內(nèi)取樣計(jì)數(shù)，驗(yàn)證實(shí)際接種密度
圖 9.接種示意圖
五、 總結(jié)
1. 采用單細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代，禁止團(tuán)塊傳代。
2. 接種細(xì)胞前，先向 Mini 反應(yīng)器罐體中加入培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱中充分平衡。
3. 檢測新鮮培養(yǎng)基的 pH 值、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物濃度，用于工藝表征、過程控制及后續(xù)放大準(zhǔn)備。
4. 制備統(tǒng)一的濃縮細(xì)胞接種液，用于同一實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)器的接種，并始終設(shè)置 2D 培養(yǎng)對照組。
5. 分裝細(xì)胞懸液前，必須充分混勻。
六、寫在后面
iPSC 細(xì)胞治療的商業(yè)化之路，離不開標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；纳a(chǎn)工藝。PBS Mini 垂直輪生物反應(yīng)器憑借其獨(dú)特的設(shè)計(jì)優(yōu)勢和經(jīng)過全球驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化流程，為 iPSC 3D 培養(yǎng)提供了從實(shí)驗(yàn)室到臨床的完整解決方案。
作為 PBS Biotech 在中國的合作伙伴，曼博生物擁有多人技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)，可為您提供從設(shè)備安裝、工藝開發(fā)到問題排查的一站式服務(wù)。如果您在 iPSC 聚集體培養(yǎng)過程中遇到任何問題，歡迎在評論區(qū)留言，或直接聯(lián)系我們的技術(shù)工程師。此外，曼博生物擁有覆蓋 iPSC 種子細(xì)胞制備、3D 培養(yǎng)工藝優(yōu)化及規(guī)?；a(chǎn)的整體解決方案，更多內(nèi)容可點(diǎn)擊訪問曼博生物官網(wǎng)查看更多關(guān)于iPSC細(xì)胞培養(yǎng)整體解決方案！
下期預(yù)告：《PBS Mini 中 iPSC 聚集體 3D 培養(yǎng)系列 3：推薦的 3D 培養(yǎng)參數(shù)》，敬請關(guān)注！
擴(kuò)展閱讀
PBS Mini 中 iPSC 聚集體 3D 培養(yǎng)系列 1：從 2D 到 3D 的無縫銜接｜曼博生物
本文基于PBS Biotech公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實(shí)驗(yàn)參考等。上海曼博生物可提供PBS Mini 垂直輪生物反應(yīng)器、PBS 垂直輪生物反應(yīng)器、iPSC 3D 聚集體培養(yǎng)、iPSC 規(guī)?；臃N、iPSC 種子細(xì)胞制備、3D 培養(yǎng)工藝優(yōu)化及規(guī)?；a(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品與技術(shù)支持，助力誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）3D 培養(yǎng)工藝標(biāo)準(zhǔn)化、臨床轉(zhuǎn)化與規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。
歡迎咨詢曼博生物查看細(xì)胞培養(yǎng)全流程解決方案！