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? ? ? ? ?蛋白印跡實(shí)驗(yàn) (WB) 廣泛用于分析細(xì)胞或組織提取物中的特異性蛋白表達(dá)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)很耗時(shí)，而且它們的成功對(duì)研究進(jìn)展有著重要影響。為此，我們?cè)陂_(kāi)發(fā)抗體時(shí)深思熟慮，提供優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)步驟以及參考信息和技術(shù)支持，以使您的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)獲得成功。

注：請(qǐng)參閱一抗產(chǎn)品網(wǎng)頁(yè)，了解推薦的一抗稀釋緩沖液和抗體稀釋度。

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A. 溶液與試劑

注：利用反滲透去離子水或同等級(jí)別的水制備溶液。

1.?20?×?磷酸鹽緩沖液 (PBS)：（P492453）為了制備1 L 1 × PBS：添加50 mL 20 × PBS至950 mL dH2O，然后將其混勻。

2.?10× Tris 鹽緩沖液 (TBS)：（T397928）要制備 1 L 1× TBS：向 900 mL dH2O 中添加100 mL 10×，然后混勻。

3.?1× SDS 樣品緩沖液：SDS-PAGE上樣緩沖液（S750311）將 SDS-PAGE 上樣緩沖液（還原，6×）與蛋白樣品按照 1：5 的比例混勻。將蛋白樣品置于沸水浴中加熱 3-5 分鐘。待蛋白樣品充分變性后冷卻至室溫，以小于 3000 rpm 的條件離心30 秒。以取適量上清

4.?10× Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液：（S301872）要制備1 L 1?×?電泳緩沖液：向900 mL dH2O中添加100 mL 10× 電泳緩沖液，然后混勻。

5.?10× Tris-Glycine 轉(zhuǎn)移緩沖液：（T492968）要制備 1 L 1× 轉(zhuǎn)移緩沖液：向 200 mL 甲醇 + 700 mL dH2O 中添加 100 mL 10× 轉(zhuǎn)移緩沖液，然后混勻。

6.?1× Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：含有20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20，pH7.6±0.1 (25℃)。

7.?Tween 20（T434505）

8.?脫脂奶粉（N752146）。

9.?RIPA Lysis Buffer（R493085）

10.?封閉緩沖液：含 5% w/v 脫脂奶粉的 1× TBST；要制備 150 mL，向 150 mL 1× TBST 中添加 7.5 g 脫脂奶粉并充分混勻。

11.?洗滌緩沖液：1× TBST。

12.?牛血清白蛋白（BSA）：（B265993）

13.?磷酸酶抑制劑混合物（P777310）

14.?蛋白酶抑制劑混合物（P301902）

15.?30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液 （A665714）

16.?過(guò)硫酸銨（A112450）

17.?PAGE凝膠快速制備試劑盒（推薦，原因比較便捷）（P777326）

18.?UltraBio? SDS-PAGE預(yù)制膠（Tris-Gly）（推薦，更為便捷）（E753596）

19.?UltraBio? SDS-PAGE預(yù)制膠 (Bis-Tris) 推薦，更為便捷，注意緩沖液為MOPS-SDS Running Buffer?T767955）（U776776）

20.?一抗稀釋緩沖液：含 5% BSA 或 5% 脫脂奶粉的 1× TBST（如一抗產(chǎn)品網(wǎng)頁(yè)所示）；如要制備 20 mL，往 20 mL 1× TBST 中添加 1.0 g BSA 或脫脂奶粉，并充分混勻。

21.?藍(lán)色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (10-250kda)：（rp210256）。

22.?印跡膜和紙：PVDF膜。通常推薦 0.22?μm（P766356） 孔徑或0.45μm（P766361）孔徑。

23.?HRP 偶聯(lián)二抗：抗兔 (Ab176443)；抗小鼠(Ab179001)。

24.?檢測(cè)試劑：ECL Plus 超敏發(fā)光液（E266188皮克級(jí)、W266209飛克級(jí)）

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B. 蛋白質(zhì)印跡

? ? ? ? ?制備樣品的常規(guī)流程：

（1）懸浮細(xì)胞裂解總蛋白的制備方法

? ? ? ? ?1.?從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿鏡下觀察細(xì)胞，確定細(xì)胞覆蓋率>70%且狀態(tài)良好。

? ? ? ? ?2.?根據(jù)需要的體積配制細(xì)胞裂解工作液，配制過(guò)程在冰上進(jìn)行；例如配置50mL的裂解工作液需要在50mL的RIPA Lysis Buffer加入0.5mL蛋白酶抑制劑混合物（P301902），并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入合適的磷酸酶抑制劑，混勻后在當(dāng)日內(nèi)使用。

? ? ? ???3.?將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞收集于離心管中，1200rpm 5min離心收集細(xì)胞

? ? ? ???4.?在離心管中加入40 mL預(yù)冷的DPBS，清洗細(xì)胞后離心去上清，清洗兩次。

? ? ? ???5.?將適量體積的裂解液和收集的細(xì)胞混合，輕輕吹散細(xì)胞，4℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀上裂解30min。注：一般一個(gè)T75需要2至3mL裂解工作液。

? ? ? ???6.?重復(fù)直至所有細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞收集完畢，4℃下在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上旋轉(zhuǎn)裂解30 min，使其充分裂解。

? ? ? ???7.?裂解完成后，4℃下8000 rpm高速離心20min。

? ? ? ???8.?棄沉淀收集上清，將收集到的裂解產(chǎn)物用0.45um過(guò)濾器過(guò)濾后收集于干凈離心管并置于冰上，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

? ? ? ???9.?細(xì)胞裂解產(chǎn)物濃縮與稀釋（該步驟針對(duì)濃度過(guò)高或者過(guò)低的Lysate）

? ? ? ???若濃度>2.5mg/mL,使用RIPA Lysis Buffer將其濃度稀釋到在1.5-2.5 mg/mL之間。若蛋白濃度<1 mg/mL，轉(zhuǎn)入步驟10-14。

? ? ? ???10.?超濾離心管使用前用移液槍吸取3mL PBS，輕輕吹打管壁和濾膜；配平后放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000G，離心5min。

? ? ? ???11.?從離心機(jī)中取出超濾離心管，倒凈濾出和未濾出的PBS，倒入Lysate溶液，配平后將超濾離心管放入離心機(jī)，使濾膜方向正對(duì)轉(zhuǎn)子中心。

? ? ? ???12.?設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000G，在超濾體積為15mL時(shí)離心20min（若裂解產(chǎn)物原始濃度異常低或高，則酌情增減離心時(shí)間）。

? ? ? ???13.?濃縮結(jié)束后，用移液槍吸出濃縮物，邊吸邊輕輕吹洗濾膜，放入干凈的離心管中。

? ? ? ???14.?對(duì)濃縮好的細(xì)胞裂解液重新進(jìn)行濃度測(cè)定，確定濃度在1-2.5mg/mL之間。按照需求進(jìn)行分裝，并做好標(biāo)記。

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（2）貼壁細(xì)胞裂解總蛋白制備方法

? ? ? ???1. 從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿鏡下觀察細(xì)胞，確定細(xì)胞覆蓋率>70%且狀態(tài)良好。

? ? ? ???2. 根據(jù)需要的體積配制細(xì)胞裂解工作液，配制過(guò)程在冰上進(jìn)行；例如配置50mL的裂解工作液：需要在50mL的RIPA Lysis Buffer中加入0.5mL蛋白酶抑制劑混合物（P301902），并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入合適的磷酸酶抑制劑，混勻后在當(dāng)日內(nèi)使用。

? ? ? ???3. 將培養(yǎng)皿置于冰上，用10mL移液管將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸盡。

? ? ? ???4. 在培養(yǎng)皿中加入5mL預(yù)冷的DPBS，清洗細(xì)胞后吸走，每皿清洗兩次。

? ? ? ???5. 每個(gè)培養(yǎng)皿加入細(xì)胞裂解工作液0.5-1mL，使用細(xì)胞刮子將裂解后的細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部完全刮下來(lái)并收集到干凈離心管內(nèi)（離心管全程置于冰上）。

? ? ? ???6．重復(fù)直至所有細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞收集完畢，4℃下在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上旋轉(zhuǎn)裂解30 min，使其充分裂解。

? ? ? ???7．裂解完成后，4℃下8000 rpm高速離心20 min。

? ? ? ???8．棄沉淀收集上清，將收集到的裂解產(chǎn)物用0.45um過(guò)濾器過(guò)濾后收集于干凈離心管并置于冰上，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

? ? ? ???9. 細(xì)胞裂解產(chǎn)物濃縮與稀釋（該步驟針對(duì)濃度過(guò)高或者過(guò)低的Lysate）

? ? ? ???若濃度>2.5mg/mL,使用RIPA Lysis Buffer將其濃度稀釋到在1.5-2.5 mg/mL之間。若蛋白濃度<1 mg/mL，轉(zhuǎn)入步驟10-13。

? ? ? ???10. 超濾離心管使用前用移液槍吸取3mL PBS，輕輕吹打管壁和濾膜；配平后放入5804R離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000G，離心5min。

? ? ? ???11. 從離心機(jī)中取出超濾離心管，倒凈濾出和未濾出的PBS，倒入Lysate溶液，配平后將超濾離心管放入離心機(jī)，使濾膜方向正對(duì)轉(zhuǎn)子中心。5.4.3 設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000G，在超濾體積為15mL時(shí)離心20min（若裂解產(chǎn)物原始濃度異常低或高，則酌情增減離心時(shí)間）。

? ? ? ???12.濃縮結(jié)束后，用移液槍吸出濃縮物，邊吸邊輕輕吹洗濾膜，放入干凈的離心管中。

? ? ? ???13.對(duì)濃縮好的細(xì)胞裂解液重新進(jìn)行濃度測(cè)定，確定濃度在1-2.5mg/mL之間。按照需求進(jìn)行分裝，并做好標(biāo)記。

C．電泳

? ? ? ? ?2.?分離膠配制（以10%為例）

? ? ? ? ?操作步驟：混合前4種成分后輕柔旋渦混勻，加入TEMED后立即灌膠至玻璃板高度80%，用異丙醇或水覆蓋表面隔絕氧氣，室溫靜置30分鐘

? ? ? ? ??3.?濃縮膠配制（5%）

? ? ? ? ?操作步驟：倒掉分離膠上層液體，濾紙吸干殘留，配制濃縮膠并灌滿剩余空間，插入梳子避免氣泡，靜置20分鐘

? ? ? ? ?也可選擇阿拉丁PAGE凝膠快速制備試劑盒或UltraBio? PAGE預(yù)制膠更加便捷！

? ? ? ? ??4. 電泳條件：

? ? ? ? ??濃縮膠：80V恒壓（約30分鐘）

? ? ? ? ??分離膠：120V恒壓（約1-1.5小時(shí)）

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? ? ? ? ??5. 轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法舉例）

? ? ? ? ??PVDF膜用甲醇活化30秒

? ? ? ? ??凝膠-膜-濾紙"三明治"結(jié)構(gòu)（避免氣泡）

? ? ? ? ??4℃條件下100V恒壓轉(zhuǎn)膜60分鐘（目標(biāo)蛋白>50 kDa需延長(zhǎng)至90分鐘）

? ? ? ? ??驗(yàn)證方法：麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)膜效率，預(yù)染Marker條帶觀察

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D.?膜封閉和抗體孵育

? ? ? ? ??封閉和抗體孵育

注：容量適用于10 cm × 10 cm（100 cm2）的膜；對(duì)于不同尺寸的膜，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整容量。

? ? ? ? ?I. 膜封閉

? ? ? ???1.?（可選）轉(zhuǎn)移之后，在室溫下用 25 mL TBS 將PVDF膜洗滌 5 分鐘。

? ? ? ???2.?將膜置于 25 mL 封閉緩沖液中，在室溫下孵育 1 小時(shí)。

? ? ? ???3.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???II. 一抗孵育

? ? ? ???根據(jù)所使用的一抗，繼續(xù)下述其中一項(xiàng)的具體步驟。

? ? ? ???（1）?對(duì)于無(wú)偶聯(lián)的一抗

? ? ? ???1.?將膜和一抗（按照產(chǎn)品官網(wǎng)中建議的適當(dāng)稀釋度和稀釋液）置于 10 mL 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜或室溫孵育1小時(shí)，并放置于搖床晃動(dòng)。

? ? ? ???2.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???3.?按一抗來(lái)源選取合適的 HRP 偶聯(lián)的二抗（(Ab176443或Ab179001），置于 10 mL 封閉緩沖液中孵育 1小時(shí)并放置于搖床攪動(dòng)。

? ? ? ???4.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???5.?繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

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? ? ? ???（2）對(duì)于偶聯(lián)有HRP 的一抗

? ? ? ???1.?將膜和一抗（按照產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中建議的適當(dāng)稀釋度）置于 10 mL 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜或室溫孵育1小時(shí)，并放置于搖床晃動(dòng)。

? ? ? ???2.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???3.?如檢測(cè)生物素化抗體或蛋白使用?Streptavidin-HRP在室溫下于 10 mL 封閉緩沖液中孵育 1 小時(shí)并放置于搖床攪動(dòng)。

? ? ? ???4.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???5.?繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

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? ? ? ???（3）對(duì)于生物素化的一抗

? ? ? ???1.?將膜和一抗（按照產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中建議的適當(dāng)稀釋度）置于 10 mL 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜并放置于搖床晃動(dòng)。

? ? ? ???2.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???3.?將膜與 Streptavidin-HRP （np156148以適宜的稀釋度）在室溫下于 10 mL 封閉緩沖液中孵育 1 小時(shí)并放置于搖床晃動(dòng)。

? ? ? ???4.?用 15mL TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

? ? ? ???5.?繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

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E. 蛋白質(zhì)檢測(cè)，ECL Western Blot Kit舉例

? ? ? ???1.?二抗孵育完畢后，將印跡膜充分洗滌。

? ? ? ???2.?根據(jù)需要量，將ECL-A和ECL-B按照1：1的比例等體積混合，配制為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物工作液（一張10 cm × 10 cm的膜大約使用2mL工作液）。

? ? ? ???3.?棄去洗滌緩沖液，將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋整張膜，室溫孵育3-5分鐘。

? ? ? ???4.?在暗室內(nèi)進(jìn)行×-光膠片曝光，或?qū)⒛し胖玫交瘜W(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，按照儀器說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

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