摘要：本文詳解肝星狀細胞與肝竇內(nèi)皮細胞的生物學特性及疾病應用，提供標準化培養(yǎng)流程，為肝病研究與藥物研發(fā)提供實驗支撐。
關鍵詞：肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、肝非實質細胞、原代肝細胞培養(yǎng)、肝纖維化模型、藥物肝毒性、人原代肝細胞、HSCs、LECs、Liver Sinusoidal Endothelial Cells、LSECs
肝非實質細胞｜肝星狀細胞與肝竇內(nèi)皮細胞—生物學特性、疾病應用及標準化培養(yǎng)指南
肝臟作為人體最大的代謝器官，其功能的正常運轉依賴于肝實質細胞與肝非實質細胞（NPCs）的協(xié)同作用。其中，肝星狀細胞（Hepatic
Stellate Cells, HSCs）和肝竇內(nèi)皮細胞（Liver Endothelial Cells,
LECs）是肝非實質細胞中關鍵的兩類細胞。它們不僅維持肝臟微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，更是肝纖維化、肝硬化、肝癌等重要肝病發(fā)生發(fā)展的核心參與者。本文將系統(tǒng)介紹這兩種細胞的生物學特性、在疾病中的作用，并重點詳解其標準化培養(yǎng)流程與關鍵技術細節(jié)，為肝病機制研究和藥物研發(fā)提供可靠的實驗基礎。
一、肝星狀細胞（HSCs）：肝臟穩(wěn)態(tài)與纖維化的"雙刃劍"
1.1 基本生物學特性
肝星狀細胞，又稱肝星形細胞，位于肝竇周隙（Disse間隙），即肝細胞與肝血竇內(nèi)皮細胞之間的狹小空間。在正常生理狀態(tài)下，HSCs處于靜息期，其最突出的特征是胞質內(nèi)含有大量富含維生素A（視黃醇）的脂滴，儲存了體內(nèi)約70~90%的維生素A。
靜息期HSCs的核心功能包括：
代謝和貯存維生素A，維持機體維生素A平衡
合成和分泌正常細胞外基質（ECM），如IV型膠原、層粘連蛋白
分泌肝細胞生長因子（HGF），參與肝細胞再生調(diào)控
通過胞突收縮調(diào)節(jié)肝竇血流，影響門靜脈壓力
當肝臟受到病毒感染、酒精損傷、代謝異常等刺激時，HSCs會被激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，這是肝纖維化發(fā)生的核心步驟。激活后的HSCs失去維生素A脂滴，大量增殖、遷移，并分泌以I型、III型膠原為主的異常ECM，同時釋放促炎和促纖維化因子，最終導致肝臟瘢痕組織形成。
圖1.人肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）
1.2 在疾病研究中的應用
HSCs的激活是肝纖維化的始動和中心環(huán)節(jié)，因此成為肝病研究的核心靶細胞：
1.3 人原代肝星狀細胞標準化培養(yǎng)流程
以下流程基于LifeNet
Health人原代肝星狀細胞的培養(yǎng)方案，適用于大多數(shù)原代HSCs的體外培養(yǎng)。
1.3.1 細胞復蘇
預熱完全培養(yǎng)基至37℃，液氮中取出凍存管快速解凍（1.5-2分鐘，勿浸瓶蓋）。酒精消毒后將細胞懸液轉移至含9
mL培養(yǎng)基的離心管，沖洗凍存管回收殘留細胞。室溫500×g離心5分鐘，棄上清，用預熱培養(yǎng)基重懸沉淀。
1.3.2 細胞鋪板
計數(shù)活細胞后，按5000個細胞/cm2密度接種。先加半量培養(yǎng)基，接種后立即晃動培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
1.3.3 細胞培養(yǎng)維護
每3-4天更換預熱的新鮮培養(yǎng)基，每日鏡檢細胞形態(tài)（靜息期呈星形，激活后變梭形）。細胞融合度達85%以上時進行傳代或凍存。
圖2.
肝星狀細胞P1代ICC分析表征圖（200倍）
1.3.4 細胞消化與傳代
預熱胰酶和培養(yǎng)基，棄舊液后用PBS洗2次。按0.038mL/cm2加胰酶體積，37℃消化2-5分鐘，加完全培養(yǎng)基終止消化。離心后按4500-5000個細胞/cm2密度接種新培養(yǎng)皿。
1.3.5 細胞凍存
預冷凍存液和凍存管，收集細胞離心后調(diào)整濃度至目標濃度，分裝至凍存管。經(jīng)程序降溫盒-80℃過夜后，轉移至氣相液氮中長期儲存。
二、肝竇內(nèi)皮細胞（LECs）：肝臟微環(huán)境的"守門人"
2.1 基本生物學特性
肝竇內(nèi)皮細胞是肝臟特有的血管內(nèi)皮細胞，構成肝血竇的血管內(nèi)襯。與其他組織的內(nèi)皮細胞相比，LECs具有兩個突出的結構特征：
這些獨特的結構使LECs成為肝臟物質交換的關鍵門戶，同時還具有強大的內(nèi)吞功能，能夠有效清除血液中的大分子廢物、病原體和衰老蛋白，被稱為體內(nèi)的"血液凈化器"。此外，LECs還通過分泌一氧化氮（NO）等旁分泌信號，維持HSCs的靜息狀態(tài)，調(diào)節(jié)肝臟微循環(huán)。
圖3.肝竇內(nèi)皮細胞（Liver Endothelial Cells, LECs）
2.2 在疾病研究中的應用
LECs的功能異常是多種肝病發(fā)生的早期事件：
肝纖維化研究：LECs毛細血管化（失去窗孔、形成基底膜）是肝纖維化的早期病理改變，先于HSCs激活
藥物肝毒性（DILI）研究：LECs是藥物進入肝臟的首要屏障，其損傷常早于肝細胞，可用于預測藥物的肝毒性
肝靶向藥物遞送：利用LECs表面高表達的Stabilin-2、甘露糖受體等，設計特異性靶向載體
非酒精性脂肪性肝?。∕AFLD）研究：LECs功能障礙參與MAFLD的發(fā)生發(fā)展，影響肝臟脂質代謝和炎癥反應
2.3 人原代肝竇內(nèi)皮細胞標準化培養(yǎng)流程
以下流程基于LifeNet
Health人原代肝竇內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方案。
2.3.1 細胞復蘇
預熱完全培養(yǎng)基，液氮凍存管37℃快速解凍至剩小塊冰，酒精消毒后轉入含9mL預熱培養(yǎng)基的15mL離心管，沖洗凍存管回收殘余細胞，500×g室溫離心5分鐘，棄上清，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。
2.3.3 細胞鋪板
計數(shù)活細胞，100mm培養(yǎng)皿先加5mL完全培養(yǎng)基，按5000個細胞/cm2接種，輕晃使細胞均勻分布，補培養(yǎng)基至10mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.3.4 細胞培養(yǎng)維護
每2-3天更換一次培養(yǎng)基
每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：正常LECs呈典型的鵝卵石樣排列，細胞邊界清晰
當細胞融合度達到85%以上時，進行傳代或凍存
2.3.5?細胞消化與傳代
預熱培養(yǎng)基和胰酶/EDTA，棄舊液，PBS洗2次，按0.05mL/cm2加胰酶（100mm皿/3mL），37℃孵育2-5分鐘至細胞變圓脫落，加完全培養(yǎng)基終止消化（0.091mL/cm2，100mm皿/5mL），收集細胞后500×g離心5分鐘，棄上清重懸，按4000-5000個細胞/cm2接種培養(yǎng)。
2.3.6 細胞凍存
凍存液和凍存管冰上預冷，按傳代步驟收集細胞，兩次500×g離心5分鐘，冰上用預冷凍存液重懸至目標濃度，分裝至凍存管，程序降溫盒-80℃過夜，次日轉移至氣相液氮長期儲存。
三、HSCs與LECs的共培養(yǎng)及應用前景
肝臟是一個高度復雜的器官，單一細胞培養(yǎng)無法完全模擬體內(nèi)的肝臟微環(huán)境。將HSCs與LECs進行共培養(yǎng)，能夠更好地重現(xiàn)肝臟的生理和病理狀態(tài)：
構建肝纖維化體外模型：共培養(yǎng)體系中，LECs的毛細血管化會誘導HSCs激活，更接近體內(nèi)肝纖維化的發(fā)生過程
藥物篩選：共培養(yǎng)模型能夠更準確地評估藥物的肝毒性和抗纖維化效果
肝臟類器官構建：將HSCs、LECs與肝細胞、庫普弗細胞共培養(yǎng)，構建功能更完善的肝臟類器官，用于再生醫(yī)學和疾病研究
LifeNet
Health可提供同一供體來源的HSCs、LECs和庫普弗細胞，避免了不同供體間的個體差異，能夠構建更穩(wěn)定、更接近生理狀態(tài)的肝臟微環(huán)境模型。
四、FAQ：肝非實質細胞常見問題
Q1：原代HSCs和LECs可以傳代多少次？
A1：人原代HSCs在體外培養(yǎng)過程中會逐漸自發(fā)激活，一般建議傳代不超過3代。超過傳代次數(shù)后，細胞會發(fā)生表型改變，影響實驗結果。
Q2：為什么HSCs接種后必須立即晃動培養(yǎng)皿？
A2：HSCs的貼壁速度非?？?，如果接種后不立即晃動，細胞會集中在培養(yǎng)皿中央，導致細胞分布不均，影響生長和后續(xù)實驗。
Q3：如何驗證HSCs的激活狀態(tài)？
A3：可以通過檢測細胞標志物的表達來驗證HSCs的激活狀態(tài)。靜息期HSCs高表達膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和脂滴相關蛋白；激活后，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和I型膠原的表達明顯升高，而GFAP表達降低。
Q4：如何驗證LECs的純度和功能？
A4：LECs的純度可以通過流式細胞術檢測內(nèi)皮細胞標志物CD31、vWF和LECs特異性標志物LYVE-1的表達來驗證。其功能可以通過檢測內(nèi)吞活性（如攝取乙?；兔芏戎鞍祝┖痛翱捉Y構（掃描電鏡觀察）來評估。
五、參考文獻
[1] Schwabe RF, Brenner DA. Hepatic
stellate cells: balancing homeostasis, hepatoprotection and
fibrogenesis in health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol,
2025.
[2] Chen G, et al. Endothelial RAP1A attenuates sinusoidal
capillarisation and liver fibrosis by inhibiting RAF1-mediated Notch
activation. Gut, 2026.
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