背景

體外診斷（IVD）是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，IVD行業(yè)成本效益比極高，僅占醫(yī)療資源的3%便掌握了70%以上的臨床決策權(quán)，是臨床醫(yī)生制定臨床治療方案的主要依據(jù)，是醫(yī)療器械中最大的細(xì)分市場(chǎng)。受新冠肺炎疫情影響，中國體外診斷市場(chǎng)近兩年呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。IVD產(chǎn)業(yè)上游在整個(gè)體外診斷產(chǎn)業(yè)鏈中具有重要的戰(zhàn)略意義，抗原抗體是診斷技術(shù)創(chuàng)新的源頭，原料的主導(dǎo)地位決定了體外診斷系統(tǒng)的性價(jià)比，也是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

目前有多種方式用于篩選診斷抗體，但是每種技術(shù)都有其局限性，例如基于血清的獲取的可變性和控制困難，雜交瘤衍生抗體的開發(fā)漫長而困難，噬菌體展示技術(shù)的免疫偏倚導(dǎo)致的序列和表位多樣性的潛在限制，以及昂貴的單個(gè)B細(xì)胞篩選。研究人員發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)質(zhì)譜測(cè)序的獲取時(shí)間更短、成本更低，被診斷公司視為一條捷徑，影響了傳統(tǒng)的抗體開發(fā)。但是在診斷性抗體的開發(fā)中，下游檢測(cè)的方法學(xué)差異和抗體可變區(qū)核心外恒定區(qū)域的影響往往被忽視。

2024年6月25日中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王戰(zhàn)輝教授團(tuán)隊(duì)在VIEW上發(fā)表了一篇名為“The challenges and breakthroughs in the development of diagnostic monoclonal antibodies”的文章，該文章深入分析體外診斷（IVD）面臨的挑戰(zhàn)，提出下一代診斷抗體開發(fā)的創(chuàng)新策略。這些策略旨在更接近抗體發(fā)現(xiàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，增強(qiáng)診斷試劑產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。

抗體發(fā)現(xiàn)

抗體于1890年被德國科學(xué)家在注射了感染破傷風(fēng)桿菌的兔子血清的小鼠中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)血清中存在著不含細(xì)胞的免疫活性物質(zhì)：抗毒素，也就是現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知的抗體。隨后證實(shí)了抗體是一類對(duì)侵入物質(zhì)具有特異性結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。然后闡明了抗體的結(jié)構(gòu)，以及抗體遺傳多樣性原理的發(fā)現(xiàn)?？贵w發(fā)現(xiàn)主要分為三個(gè)階段，第一階段是血清學(xué)說，在血清中發(fā)現(xiàn)了抗體；第二階段是免疫細(xì)胞學(xué)說，明確了B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的理論基礎(chǔ)；第三階段是遺傳多樣性學(xué)說，闡明了抗體遺傳物質(zhì)的產(chǎn)生過程。基于這些理論，抗體的獲取方法學(xué)被陸續(xù)開發(fā)出來，包括通過血清的方法獲取抗體；通過雜交瘤技術(shù)將產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與不斷增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合，從而產(chǎn)生具有相同特異性的單克隆抗體；通過噬菌體展示技術(shù)深入發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)并結(jié)合重組蛋白表達(dá)進(jìn)行繁殖，利用該方法可以獲得高親和力、高特異性的單克隆抗體，對(duì)生命科學(xué)中的分子識(shí)別和疾病治療具有重要意義；以及目前蓬勃發(fā)展的單B細(xì)胞篩選結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，一般動(dòng)物免疫后，脾臟、淋巴系統(tǒng)和外周血中均含有能分泌單個(gè)抗體的B細(xì)胞，該技術(shù)能篩選出能有效分泌目標(biāo)抗體的B細(xì)胞并從其遺傳物質(zhì)中獲取抗體基因序列。

此外，隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)序可以繞過單個(gè)B細(xì)胞，從靶向角度出發(fā)，從血清中富集針對(duì)抗原的有效抗體，利用質(zhì)譜技術(shù)獲得目標(biāo)抗體的蛋白質(zhì)序列，從而獲得候選目標(biāo)抗體。

診斷抗體研發(fā)問題分析

動(dòng)物免疫階段問題

抗體制備過程中免疫原的設(shè)計(jì)和獲取對(duì)免疫效果起著至關(guān)重要的作用。因此從免疫原獲取的角度看，存在以下問題：抗原靶點(diǎn)的復(fù)制難度較大，尤其是一些膜蛋白，表達(dá)周期長，開發(fā)成本高。免疫蛋白的來源主要依賴兩種方式：天然提取和重組蛋白。天然提取只能獲得部分免疫原性的蛋白，對(duì)于大多數(shù)項(xiàng)目來說，免疫原主要依賴重組蛋白，在設(shè)計(jì)重組蛋白時(shí)，需要分析蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等，選取結(jié)構(gòu)表位或線性表位。另外，一些抗原蛋白極不穩(wěn)定，需要以特定的配方保存。作為免疫原，稍有不慎導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，就無法得到對(duì)真正抗原具有良好特異性的抗體。實(shí)現(xiàn)免疫蛋白的精準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)是目前篩選優(yōu)質(zhì)診斷抗體的難點(diǎn)。免疫效率有待提升，隨著臨床生物標(biāo)志物對(duì)精準(zhǔn)檢測(cè)的需求越來越大，對(duì)診斷抗體原料的要求已經(jīng)不再是簡(jiǎn)單的識(shí)別抗原，而是需要高親和力，同時(shí)還要有高線性。

抗體篩選系統(tǒng)問題

單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)研發(fā)經(jīng)歷了三個(gè)階段，分別是雜交瘤技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)，單B細(xì)胞篩選技術(shù)，但是每種技術(shù)也都有他的局限性。

雜交瘤技術(shù)：其周期相對(duì)較長，在沒有動(dòng)物免疫的情況下需要4-6個(gè)月。由于PEG融合的成功率較低，大約百分之一的陽性篩選率，因此使用電穿孔、仙臺(tái)病毒或其他病毒等替代方法提高雜交瘤融合效率。此外，由于雜交瘤細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性成分比例較高，且存在部分抗體產(chǎn)量較低的雜交瘤，不適合在GMP級(jí)生物反應(yīng)器中長期有效使用。而且在培養(yǎng)初期，部分低產(chǎn)克隆生長速度可能快于高產(chǎn)克隆，導(dǎo)致在分子單克隆篩選時(shí)被排除。從腹水中制備抗體需要建立大型動(dòng)物設(shè)施，運(yùn)營成本高昂，未來還可能引發(fā)與動(dòng)物福利相關(guān)的倫理問題。

噬菌體展示技術(shù)：噬菌體表面可展示的蛋白質(zhì)肽段長度有限，傳統(tǒng)的Y型抗體篩選只能展示scFv部分，難以獲得自然配對(duì)的重鏈和輕鏈組合。通過噬菌體展示技術(shù)從B細(xì)胞中獲取有效抗體序列一般需要3-5輪篩選，而且設(shè)計(jì)的引物存在局限性，無法有效獲得所有有效抗體序列。此外，由于篩選過程需要反復(fù)洗滌，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成了很大的時(shí)間和精力負(fù)擔(dān)。

單B細(xì)胞篩選技術(shù)：在篩選過程中，高通量的單個(gè)B細(xì)胞面臨一定的挑戰(zhàn)，在獲得數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)候選抗體序列后，對(duì)這些序列進(jìn)行打分排序，并確認(rèn)最優(yōu)的抗體或一系列抗體組合，需要大量的重組表達(dá)和驗(yàn)證工作。此外，基于此類孔分離技術(shù)的篩選以及后續(xù)的表達(dá)驗(yàn)證對(duì)研發(fā)成本提出了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。

抗體表達(dá)再現(xiàn)問題

異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)存在局限性：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不適合表達(dá)完整的抗體分子，只能表達(dá)單鏈抗體或抗體片段；酵母、昆蟲和植物等雖然也具備類似糖基化的翻譯后修飾功能，但與人或哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞相比，這些細(xì)胞的糖基化模式不同，其表達(dá)的重組抗體與人天然抗體的質(zhì)量差異較大，只有哺乳動(dòng)物細(xì)胞才適合表達(dá)異源人抗體。

構(gòu)建高產(chǎn)細(xì)胞珠存在挑戰(zhàn)：目前國際上用于重組抗體生產(chǎn)的工程化細(xì)胞株表達(dá)量可達(dá)20～70 pg/細(xì)胞/天。通過細(xì)胞工程技術(shù)、位點(diǎn)特異性整合技術(shù)和高通量篩選等方法來提高細(xì)胞株的生長和表達(dá)能力，基因組學(xué)分析表明，高產(chǎn)細(xì)胞株的表達(dá)能力是多種細(xì)胞屬性協(xié)同作用的結(jié)果，包括能量代謝、氧化還原狀態(tài)、生長能力和蛋白加工能力等。

診斷抗體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有待深入探索：近95%的診斷原材料企業(yè)主要關(guān)注完整抗體基因序列的復(fù)制，而沒有深入考慮抗體的結(jié)構(gòu)差異及其對(duì)下游試劑的后續(xù)影響?？贵wFc區(qū)的作用、誘發(fā)人抗鼠抗體（HAMA）效應(yīng)等問題需要進(jìn)一步研究。關(guān)于重新配置和重新排列傳統(tǒng)IgG抗體中的Fv、CH1（CL）、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域以實(shí)現(xiàn)多樣化的概念框架的潛在好處仍然存在疑問。

診斷單抗挑戰(zhàn)及探索策略

針對(duì)上述的一些技術(shù)挑戰(zhàn)，研究人員提出了新一代診斷性單克隆抗體開創(chuàng)性開發(fā)方法，并全面實(shí)施。

RNA免疫：RNA疫苗的出現(xiàn)利用病毒的遺傳密碼“誘騙”人體細(xì)胞產(chǎn)生與病原體表面相同的蛋白質(zhì)，在迅速應(yīng)對(duì)新型傳染病爆發(fā)方面具有無與倫比的優(yōu)勢(shì)，采用RNA疫苗模式，不僅有效解決了獲取復(fù)雜免疫原的問題，而且通過繞過傳統(tǒng)的免疫原復(fù)制或純化步驟，增強(qiáng)了免疫原的原始構(gòu)象，理論上提高了免疫反應(yīng)的有效性。從成本角度來看，這種方法大大縮短了開發(fā)周期，并降低了與免疫原獲取相關(guān)的費(fèi)用。

計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)：在獲得大量候選抗體序列后，利用計(jì)算抗體平臺(tái)模擬候選抗體與抗原的結(jié)合位點(diǎn)和親和力排名，可以從數(shù)百到數(shù)千個(gè)候選抗體中精確選擇出數(shù)十種最佳診斷抗體。這種方法大大降低了復(fù)制的通量和成本，為生物技術(shù)與計(jì)算機(jī)信息技術(shù)（BTIT）的融合提供了一條有希望的途徑，以完成單B細(xì)胞高通量抗體開發(fā)的最后一塊拼圖。

診斷抗體的模塊化定制：治療性抗體已經(jīng)呈現(xiàn)出各種結(jié)構(gòu)合理的設(shè)計(jì)，如納米抗體、雙特異性抗體、三價(jià)抗體，四價(jià)抗體，而診斷抗體只涉及納米抗體和Fab抗體相關(guān)的小部分產(chǎn)品。隨著未來對(duì)簡(jiǎn)化流程的需求和新方法的出現(xiàn)，抗體的模塊化定制是必然趨勢(shì)。系統(tǒng)地組織和研究抗體的模塊化設(shè)計(jì)將對(duì)ADC/AOC中藥物分子/核酸的定向負(fù)載和ACC中抗體的高豐度負(fù)載具有重要意義。未來新方法的出現(xiàn)無疑將要求抗體結(jié)構(gòu)的多樣性，為診斷抗體和生物制藥發(fā)展的進(jìn)步提供重要機(jī)遇。

蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)的利與弊

蛋白質(zhì)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：蛋白質(zhì)測(cè)序主要有兩種：Edman降解測(cè)序和基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)測(cè)序，Edman測(cè)序方法無需蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可直接分析氨基酸信息，對(duì)于從游離的α-氨基開始表征蛋白質(zhì)的N端尤為重要。然而，Edman測(cè)序在序列長度和游離α-氨基的可用性方面存在局限性?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)測(cè)序，在從N端進(jìn)行的蛋白質(zhì)測(cè)序取得了重大進(jìn)展。質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)可以通過系統(tǒng)性地分解肽段來確定完整的蛋白質(zhì)序列，包括翻譯后修飾。為對(duì)動(dòng)物血清中的多克隆抗體進(jìn)行測(cè)序提供了一種潛在的解決方案，可以繞過單個(gè)B細(xì)胞或有效遺傳物質(zhì)篩選的繁瑣而昂貴的過程。直接從末端獲取有效抗體的序列信息大大縮短了開發(fā)周期，徹底改變了診斷抗體的開發(fā)，進(jìn)而改變了治療性抗體的開發(fā)。蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)可以用于快速測(cè)序新冠病毒中和抗體，為診斷抗體開發(fā)提供新思路。將蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)與計(jì)算機(jī)輔助抗體設(shè)計(jì)平臺(tái)相結(jié)合，可以從大量多克隆抗體序列中精準(zhǔn)篩選出最優(yōu)單克隆抗體。

蛋白質(zhì)測(cè)序的劣勢(shì)：由于診斷抗體知識(shí)產(chǎn)權(quán)體系不完善，以及IVD試劑中抗體的低消耗和復(fù)雜性，很多IVD廠商基于蛋白從頭測(cè)序技術(shù)，由原來的診斷抗體正向開發(fā)或外包，轉(zhuǎn)向全球抗體分析試驗(yàn)，基于蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)的逆向開發(fā)和復(fù)制，可能會(huì)嚴(yán)重打擊正向開發(fā)診斷抗體的積極性，導(dǎo)致整個(gè)行業(yè)發(fā)展緩慢。

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總結(jié)與展望

抗體篩選的方式目前主要有雜交瘤技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)，單B細(xì)胞篩選技術(shù)。診斷抗體乃至治療性抗體研發(fā)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于抗體序列的發(fā)現(xiàn)，抗體質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)的成熟意味著研究人員可以繞過動(dòng)物免疫和細(xì)胞篩選等繁瑣的抗體序列發(fā)現(xiàn)過程。僅利用歷史抗體-抗原數(shù)據(jù)、服務(wù)器和算法即可生成新的抗體序列。隨著蛋白質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)的成熟和商業(yè)化應(yīng)用，其相對(duì)較短的序列獲取時(shí)間和相比正向開發(fā)顯著降低的測(cè)序成本，讓更多診斷公司將其視為抗體開發(fā)的捷徑。但是我們需要合理的使用，反向抗體開發(fā)的濫用，雖然會(huì)給診斷抗體產(chǎn)業(yè)帶來短期的盈利，但最終也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)領(lǐng)域發(fā)展緩慢甚至停滯。我們需要重新定義診斷抗體的結(jié)構(gòu)，從抗體結(jié)構(gòu)角度分析抗體在診斷中的方法論，進(jìn)一步分化抗體的設(shè)計(jì)，對(duì)提升診斷試劑的性能至關(guān)重要，是未來診斷抗體發(fā)展中不可或缺的階段?，F(xiàn)階段，診斷抗體的開發(fā)需要原始理論創(chuàng)新與前沿技術(shù)突破的有機(jī)結(jié)合，具體表現(xiàn)為新型免疫機(jī)制與高通量篩選技術(shù)的協(xié)同、計(jì)算抗體平臺(tái)的建立、新方法與抗體結(jié)構(gòu)機(jī)理研究的結(jié)合。戰(zhàn)略定位基于AI生成的抗體平臺(tái)也被認(rèn)定為保持診斷抗體開發(fā)行業(yè)領(lǐng)先地位的有效途徑之一。

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