背景

單克隆抗體廣泛用于多種疾病的治療，包括癌癥，自身免疫性疾病和代謝紊亂，截止2024年6月24日，全球有近214種治療性抗體藥物已獲批準或正在進行監(jiān)管審查（關注公眾號“邁思生物”，回復“Antibody”獲取抗體藥物信息）。與小分子藥物相比，治療性抗體藥物一般對靶抗原具有較強的結合效力，提供了高特異性、高靶標占用率、低脫靶毒性的可能性。靶標結合是治療性抗體發(fā)揮藥理活性的必要條件，精確測量治療性抗體的結合活性變化對于確定抗體早期可發(fā)展性評估中的潛在關鍵質量屬性（CQAs）具有重要意義。

2024年7月2日先聲藥業(yè)研究人員在MAbs上發(fā)表了一篇名為“Early determination of potential critical quality attributes of therapeutic antibodies in developability studies through surface plasmon resonance-based relative binding activity assessment”的文章，研究人員開發(fā)了一種基于SPR的相對結合活性方法，該方法結合了結合親和力和結合反應，能夠以高精度和精密度確定抗體的相對結合活性。將基于SPR的相對結合活性方法應用于抗體可開發(fā)性評估的多項強制降解研究中。當前的可開發(fā)性評估策略在穩(wěn)定性研究中提供了抗體結合活性的全面、精確表征，能夠進行相關性分析并建立相對結合活性與質量屬性之間的結構-功能關系。無需分離抗體變體，即可自信地確定給定質量屬性對結合活性的影響。研究人員還確定了幾種潛在的CQA，包括Asp異構化、Asn脫酰胺和碎片化。

基于SPR的相對結合活性方法概述

從活性角度來看，抗體樣本可分為兩個主要的亞群，即活性抗體和非活性抗體，其中活性抗體包括部分活性抗體和完全活性抗體。因此了解活性抗體的活性水平及其在檢測樣本中的豐度將使我們能夠確定抗體的結合效力水平。基于SPR的結合動力學分析提供了多個抗體-抗原結合參數(shù)，包括結合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd、平衡解離常數(shù)KD、最大結合響應Rmax和抗體捕獲水平。在抗體捕獲結合動力學分析中，KD常數(shù)已被廣泛用于代表抗體結合強度，最大結合響應（Rmax）反映抗體結合能力。對于以參考標準歸一化的測試樣本相對結合活性評估，首先，對于測試樣本的相對Rmax，通過相關的捕獲水平對Rmax進行歸一化，即歸一化Rmax。相對KD反映抗體的相對結合強度，相對Rmax反映抗體的相對結合能力。因此，測試樣本的相對結合活性由相對Rmax與相對KD相乘得出，其表征測試樣本相對于參考標準的整體相對結合活性水平。基于SPR的相對結合活性方法為結合活性改變提供了三層表征：基于KD變化的降低，基于Rmax變化的損失， 以及同時考慮KD和Rmax的總體變更。

案例研究1：Asp26異構化導致mAb-A的結合活性顯著降低

第一個案例涉及一種稱為mAb-A的IgG4抗體，研究人員對mAb-A在微酸性pH 5.5和中性pH 7.4緩沖液中的熱應力穩(wěn)定性進行了研究。應用基于SPR的相對結合活性法在強制降解實驗中評估了mAb-A的結合活性，發(fā)現(xiàn)微酸性和中性穩(wěn)定性研究中，相對KD和相對結合活性均呈時間依賴性顯著降低，而相對Rmax則呈輕度降低。表明mAb-A相對結合活性的改變主要與相對KD相關，這是通過降低結合親和力實現(xiàn)的。

研究人員研究了與mAb-A相對結合活性改變相關的生物物理特性，基于質譜的肽圖分析表明，在微酸性和中性穩(wěn)定性研究中，Asp26和重鏈CDR1區(qū)的組氨酸異構化呈現(xiàn)出時間依賴性增加。

之前也有報導重鏈CDR2區(qū)域的Asp- his基序中出現(xiàn)了高異構化，顯著影響了抗體結合活性。

研究人員發(fā)現(xiàn)Asp26異構化的增加和相對KD和相對結合活性的變化密切相關，Asp26異構化能顯著影響mAb-A的結合親和力。研究人員觀察到相對KD和相對kd有明確的相關性，表明相對KD減少與解離率增加相關。研究人員鑒定了D26T突變體并在微酸性溶液中進行熱應力測試。與mAb-A野生型（WT）相比，觀察到D26T突變體的相對KD和相對結合活性略有降低，證實了Asp26異構化是導致相對KD降低的主要原因，并且在穩(wěn)定性研究期間可顯著影響mAb-A的結合活性。這些結果表明，重鏈Asp26異構化可通過提高解離率，顯著影響mAb-A的結合活性，因此被認為是mAb-A抗體開發(fā)的潛在CQA。

研究人員對基于SPR的相對結合活性法和基于SPR的相對活性濃度法進行了直接比較，建立了經(jīng)典的基于SPR的mAb-A活性濃度檢測方法，并在微酸性和中性穩(wěn)定性研究中檢測到相對活性濃度的輕微變化。發(fā)現(xiàn)所有的相對活性濃度都大于95%，證明了活性濃度方法不能監(jiān)測解離率的變化。

案例研究2. 碎片化導致mAb-B的結合活性顯著下降

第二個病例研究涉及稱為mAb-B的IgG1抗體，研究人員對mAb在中性pH 7.4和微酸性pH 6.0下的熱應力穩(wěn)定性進行了研究。發(fā)現(xiàn)與案例1中一樣，中性和微酸性穩(wěn)定條件下，相對KD和相對結合活性均呈時間依賴性顯著降低，而相對Rmax則呈輕度降低。mAb相對結合活性的改變主要通過降低結合親和力與相對KD相關。通過研究與與mAb相對結合活性變化相關的質量屬性，nrCE-SDS分析顯示，在中性和微酸性穩(wěn)定性研究中，片段數(shù)呈時間依賴性增加。

研究人員通過MS分析，測量了片段的分子量，并定位了輕鏈（LC）CDR3區(qū)天冬酰胺93和脯氨酸94之間的剪切點。研究人員也發(fā)現(xiàn)片段的增加與相對KD和相對結合活性表現(xiàn)出良好的相關性，相對KD與相對kd有明確的相關性，表明解離率的增加是相對KD減少的原因。輕鏈CDR3區(qū)域的Asn-Pro片段可通過減少KD，提高解離率，顯著影響mAb-B的結合活性，并被認為是mab抗體開發(fā)的潛在CQA。

研究人員制備了N93L突變體并在中性溶液中進行了熱應力研究。與mAb-B WT相比，相對結合活性分析表明，N93L突變體的相對KD和相對結合活性均有輕微降低。這證實了Asn-Pro碎片化是造成相對KD降低的主要原因，并且可能在穩(wěn)定性研究期間顯著影響mAb-B的結合活性。

案例研究3. Asp53異構化導致mAb-C結合活性喪失

第三個病例研究涉及一種與IgG4 Fc抗體融合的VHH，稱為mAb-C。研究人員對mAb-C在微酸性pH 5.5緩沖液中的熱強迫降解進行了研究。在穩(wěn)定性研究中應用了基于SPR的相對結合活性法來監(jiān)測mAb-C的結合活性。發(fā)現(xiàn)相對Rmax和相對結合活性呈時間依賴性顯著降低，而相對KD呈輕度降低。相對Rmax的降低表明部分mAb-C抗體在熱應力作用下完全喪失結合活性。肽圖分析表明，Asp53和甘氨酸在CDR2區(qū)域的異構化呈時間依賴性增加。

Asp53異構化增加與相對Rmax和相對結合活性有明確的相關性，Asp53異構化的增加量與相對Rmax的降低水平相等，表明Asp53異構化完全消除了抗體結合活性。Asp53異構化可能導致穩(wěn)定性研究期間結合活性喪失，并被視為mAb-C抗體開發(fā)的潛在CQA。

研究人員設計G54A突變體，并在微酸性緩沖液中進行了熱穩(wěn)定性研究。與mAb-C WT相比，相對結合活性分析顯示，對于G54A突變體，相對Rmax和相對結合活性呈時間依賴性輕度降低。肽圖分析發(fā)現(xiàn)，在該突變體中，Asp53異構化略有增加，Asp53異構化水平的增加與相對Rmax水平的降低基本相等。這證實了Asp53異構化導致相對Rmax降低，并在穩(wěn)定性研究中完全削弱了mAb-C的結合活性。

案例研究4. 低豐度Asn33脫酰胺被確定為mAb-D的潛在CQA

第四個案例研究涉及一種名為mAb-D的IgG4抗體。研究人員對mAb-D在微酸性pH 5.5和中性pH 7.4緩沖液中的熱強迫降解進行了研究。利用基于SPR的相對結合活性方法，觀察到無論在微酸性還是中性穩(wěn)定性研究中，相對KD、相對Rmax和相對結合活性均呈現(xiàn)出時間依賴性的降低趨勢。

研究人員通過研究與mAb-D的相對結合活性變化相關的生物物理性質，肽圖分析表明，在微酸性和中性穩(wěn)定性研究中，Asn33和輕鏈CDR1區(qū)的絲氨酸脫酰胺均呈現(xiàn)出時間依賴性增加。

研究人員分析其相對KD，相對Rmax和相對結合活性的相關性，結果發(fā)現(xiàn)Asn33脫酰胺的增加與所有三種相對結合活性指標密切相關，并且相對KD與相對kd有明確的相關性，相對KD的減少與解離率的增加相關。

為了證實Asn33脫酰胺對mAbD結合活性的影響，研究人員在pH 9.0的緩沖液中進行了高pH脅迫穩(wěn)定性研究。Asn33脫酰胺顯著增加，而相對KD、相對Rmax和相對結合活性顯著降低。天冬酰胺脫酰胺反應會產(chǎn)生三種主要產(chǎn)物：琥珀酰亞胺、天冬氨酸和異天冬氨酸。研究人員推測Asn33脫酰胺通過不同的脫酰胺變體影響抗體結合親和力和結合反應，并導致結合活性的顯著降低。在穩(wěn)定性研究中，輕鏈Asn33脫酰胺對mAb-D的結合活性有明顯影響，因此研究人員將視為mAb-D抗體開發(fā)的潛在CQA。

基于SPR的相對結合活性方法作為潛在的質量控制釋放試驗

研究人員對基于SPR的相對結合活性方法進行了方法鑒定研究，并確定了分析程序鑒定的關鍵參數(shù)，包括準確度、精確度、靈敏度、穩(wěn)健性和系統(tǒng)適用性。研究人員對來自mAb-A、mAb-B和mAb-C的五組穩(wěn)定性樣品在約40天內進行了9次基于SPR的相對結合活性分析。結果表明，基于SPR的相對結合活性方法具有合適的準確度、較高的重現(xiàn)性和良好的穩(wěn)定性，支持了基于SPR的相對結合活性方法作為質量控制放行和穩(wěn)定性測定的潛力。

總結與展望

在抗體藥物開發(fā)的早期階段，精確測量抗體結合活性的變化對于識別潛在的關鍵質量屬性（CQAs）至關重要。在此，報告了一種基于傳統(tǒng)抗體捕獲結合動力學模式的新型SPR分析程序，該程序結合了結合親和力和結合響應，使我們能夠以適當?shù)臏蚀_度和高精度確定抗體的相對結合活性。通過這種方法，在抗體開發(fā)能力評估中確定了多種潛在的CQAs，包括片段化、Asp異構化和Asn脫酰胺化。這些潛在CQAs可能通過增加解離率來影響抗體結合親和力，導致結合活性降低；或者通過損害抗體與抗原的結合，導致結合活性喪失。SPR相對結合活性方法易于使用，無需復雜的檢測方法開發(fā)，適用于大多數(shù)治療性抗體，可以應用于抗體開發(fā)的多個階段。SPR相對結合活性方法代表了在開發(fā)階段評估治療性抗體相對結合活性的一個重大進展，這種方法采用易于使用的抗體捕獲結合動力學模式，可以應用于大多數(shù)治療性抗體。