背景

在過(guò)去10年中，利用適應(yīng)性免疫反應(yīng)來(lái)摧毀腫瘤的癌癥免疫療法取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，特別是在延長(zhǎng)危及生命的惡性腫瘤患者的生存期方面。T細(xì)胞在癌癥免疫療法的臨床成功中具有核心作用，因?yàn)樗鼈兡軌驈?qiáng)大地殺傷腫瘤細(xì)胞，并且可以向其他免疫細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，以協(xié)助破壞腫瘤。T細(xì)胞銜接器（T-cell engager，TCE）雙特異性抗體是免疫療法的一個(gè)亞群，是能夠指導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤的工程抗體藥物。TCE通過(guò)雙特異性抗體的一臂與T細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體（通常是CD3）結(jié)合，而另一臂與癌細(xì)胞上的細(xì)胞表面抗原結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。當(dāng)靶抗原也存在于健康細(xì)胞上時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生靶向、腫瘤外毒性。TCE給藥時(shí)可能會(huì)伴有毒性副作用，從而限制劑量。包括TCE在內(nèi)的強(qiáng)效T細(xì)胞活化療法常伴有細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的嚴(yán)重毒性。輕度CRS患者可以接受治療和支持，而重度CRS患者則需要干預(yù)和終止治療，這限制了TCE的治療時(shí)間窗。

（數(shù)據(jù)來(lái)源 Singh A, et al. Br J Cancer. 2021）

2024年7月4日，研究人員在MAbs上發(fā)表了一篇名為“Engineering a tumor-selective prodrug T-cell engager bispecific antibody for safer immunotherapy”的文章，研究人員解析了一種新型抗CD3抗體（E10）的抗原結(jié)合片段與其CD3表位的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并利用這些信息設(shè)計(jì)出一種可被腫瘤富集的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）激活的掩蔽型抗體。證明了這種前藥TCE能夠依賴(lài)于MMP-2的腫瘤選擇性T細(xì)胞活性，證明了類(lèi)似的掩蔽策略可用于創(chuàng)建常用的抗CD3抗體SP34的前藥物形式。該研究展示了一種開(kāi)發(fā)優(yōu)先考慮安全性的免疫調(diào)節(jié)療法的方法，并有可能推進(jìn)癌癥免疫治療的治療策略。

抗CD3 mAb克隆E10與CD3ε肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)

E10 mAb是由重組人/獼猴CD3εγ-Fc免疫兔子而產(chǎn)生的，為了揭示兔mAb E10如何與CD3ε結(jié)合，研究人員解析了E10的Fab與獼猴CD3εγ-histag蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。獼猴CD3εγ-histag蛋白的N端只有7個(gè)氨基酸（PCA-DGNEEM，其中PCA是焦谷氨酸），表明CD3ε的N端代表了全部表位。在結(jié)構(gòu)中，CD3ε肽N端焦谷氨酸深埋在抗體Fab的VH和VL結(jié)構(gòu)域之間形成的凹槽中，在那里它形成幾個(gè)疏水和極性相互作用。焦谷氨酸的亞甲基與重鏈（HC）上的Ile97以及輕鏈（LC）上的Tyr93和Ile101之間發(fā)生疏水相互作用。焦谷氨酸的側(cè)鏈羰基與HC-Ile99和HC-Gly100的主鏈酰胺基團(tuán)之間形成氫鍵。焦谷氨酸的主鏈羰基還與HC-Arg96形成氫鍵。CD3ε肽殘基Asp2通過(guò)與HC-Arg96形成氫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定相互作用。CD3殘基Gly3和Glu5與LC-Tyr93和LC-Tyr99之間也形成氫鍵。這一結(jié)果促使研究人員假設(shè)CD3肽可以以某種方式連接到E10的N末端，從而使其能夠結(jié)合并掩蓋E10的CDR區(qū)域。

CD3ε變體的親和力測(cè)定

研究人員使用熒光偏振（FP）測(cè)量來(lái)確定人源化的E10抗體（hE10）Fab結(jié)構(gòu)域?qū)Ω鞣NCD3ε肽變體的結(jié)合親和力。使用TAMRA標(biāo)記的WT CD3ε肽（序列PCA-DGNEEM），確定了相互作用的平衡解離常數(shù)（KD）為45±25nM。與晶體結(jié)構(gòu)一致，將Asp2或Glu5突變?yōu)楸彼?，兩者都與抗體CDR環(huán)形成氫鍵，降低了結(jié)合親和力。表明這兩個(gè)氨基酸在hE10中發(fā)揮重要作用。

pro-TCE的設(shè)計(jì)

CD3ε多肽與hE10的CDR環(huán)的緊密親和力表明其可作為一種有效的掩蔽結(jié)構(gòu)域來(lái)制備條件激活的TCE。在晶體結(jié)構(gòu)中，E10抗體LC的N端位于CD3ε肽末端14 ?處；研究人員使用不同長(zhǎng)度的甘氨酸絲氨酸連接體進(jìn)行了分子模擬，連接體中也包括MMP-2裂解位點(diǎn)。模擬結(jié)果表明，與兩個(gè)MMP-2裂解位點(diǎn)（序列PLG/LAGPLG/LAG-GGGS）結(jié)合的4-殘基連接體足以使CD3ε肽與其結(jié)合位點(diǎn)相互作用。為了屏蔽hE10，研究人員使用了與CD3ε的野生型（WT）序列（PCA-DGNEEM）略有不同的屏蔽序列（PCADGQESM）。使用FP測(cè)量了在用MMP-2蛋白酶處理之前和之后掩蔽的hE10 Fab對(duì)TAMRA-CD3ε肽的親和力，發(fā)現(xiàn)掩蔽的Fab對(duì)肽沒(méi)有親和力，而蛋白酶處理的Fab與TAMRA-CD3ε肽結(jié)合的測(cè)量KD為21 ± 16 nM。表明在CD3ε肽段和抗體之間加入含有MMP-2剪切位點(diǎn)的柔性連接子，可以在MMP-2存在時(shí)使CD3ε肽段從抗體上解離，從而激活抗CD3抗體的功能。

Pro-TCE的生成和物理特性

研究人員設(shè)計(jì)了一種雙特異性IgG抗體，創(chuàng)建了一種可誘導(dǎo)的TCE，該抗體將掩蔽的hE10作為抗體的一方，將抗人表皮生長(zhǎng)因子2（HER2）抗體（pertuzumab）作為抗體的另一方。為了促進(jìn)IgG抗體在表達(dá)期間的高效組裝，研究人員在HC/LC界面加入了OrthoMab突變，從而有利于hE10 LC與hE10 HC的配對(duì)，以及pertuzumab的LC和HC的配對(duì)?？贵w的Fc也包含突變，從而促進(jìn)hE10/pertuzumab異源二聚體的形成，而非形成hE10和pertuzumab的同源二聚體。HER2（一種在幾種實(shí)體腫瘤中表達(dá)的蛋白質(zhì)，也是腫瘤學(xué)中公認(rèn)的臨床靶點(diǎn)），以將原型pro-TCE活性導(dǎo)向相關(guān)的靶腫瘤抗原。

將pro-TCE雙特異性抗體在Expi293F哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，并通過(guò)蛋白A樹(shù)脂純化，之后進(jìn)行凝膠過(guò)濾，獲得雙特異性抗體樣本。研究人員使用生化遷移率-凝膠位移試驗(yàn)，分析在pro-TCE與MMP-2蛋白酶孵育前后凝膠遷移率/蛋白分子量的變化來(lái)觀察蛋白水解。發(fā)現(xiàn)使用純化的重組MMP-2進(jìn)行蛋白水解后，我們觀察到抗CD3 LC發(fā)生了質(zhì)量偏移，對(duì)應(yīng)于前藥抗CD3成分在pro-TCE上成功裂解。

研究人員利用TAMRA-CD3ε多肽的FP檢測(cè)和重組全長(zhǎng)CD3胞外結(jié)構(gòu)域（CD3γε）的生物膜干涉（BLI）技術(shù)，證實(shí)pro-TCE雙特異性抗體對(duì)靶抗原CD3保持了較高的親和力和特異性。研究人員發(fā)現(xiàn)活化的pro-TCE與CD3的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力與親本抗CD3 hE10單克隆抗體相似，pro-TCE抗體與HER2的結(jié)合親和力與親本抗HER2抗體pertuzumab相同，并且蛋白酶處理不會(huì)干擾結(jié)合。FP和BLI數(shù)據(jù)顯示，pro-TCE原型具有功能性體外結(jié)合行為，其中CD3結(jié)合在蛋白水解之前被掩蓋，并通過(guò)與重組MMP-2孵育而完全恢復(fù)。

研究人員將pro-TCE的熱穩(wěn)定性與其親本抗CD3和抗HER2單克隆抗體進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)雙特異性pro-TCE在生理溫度以上仍保持良好折疊，并且與親本單克隆抗體具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。

pro-TCE的功能性驗(yàn)證

研究人員使用NFAT熒光素酶報(bào)告共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了pro-TCE雙特異性抗體激活Jurkat T細(xì)胞與HER2表達(dá)SKOV-3細(xì)胞共培養(yǎng)的能力，發(fā)現(xiàn)Pro-TCE在使用MMP-2激活后能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞激活和殺死靶HER2抗原的腫瘤細(xì)胞。在CRS期間，T細(xì)胞會(huì)釋放大量促炎細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)Pro-TCE由于存在掩蔽域，不會(huì)觸發(fā)強(qiáng)勁的細(xì)胞因子分泌；而具有蛋白水解活性的pro-TCE會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-2，IFN-γ 的分泌。

pro-TCE觸發(fā)T細(xì)胞的條件激活

研究人員將pro-TCE與分泌MMP-2蛋白酶的HER2表達(dá)胃癌細(xì)胞系NCI-N87共培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè) pro-TCE蛋白水解和Jurkat NFAT-熒光素酶T細(xì)胞活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌的MMP-2誘導(dǎo)的pro-TCE蛋白水解可以觸發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)中的T細(xì)胞活化。

擴(kuò)展pro-TCE平臺(tái)

研究人員使用SP34抗體序列代替hE10制作了一種識(shí)別CD3ε的pro-TCE，其中包括替代CD3ε肽（序列PCA-DGQESM），該肽通過(guò)優(yōu)化的柔性接頭與抗體連接，接頭中含有MMP-2蛋白酶切割位點(diǎn)。另一條結(jié)合臂識(shí)別HER2，其序列與源自pertuzumab的原始pro-TCE相同。使用Jurkat NFAT熒光素酶報(bào)告基因共培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在裂解之前，Jurkat T細(xì)胞在與表達(dá)HER2的 SKOV-3細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有被激活。MMP-2蛋白水解后，T細(xì)胞活化得以恢復(fù)，這表明抗CD3克隆hE10和SP34均可用于pro-TCE形式，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合相同的CD3ε表位。

總結(jié)

本研究開(kāi)發(fā)了模塊化的pro-TCE，它的設(shè)計(jì)利用了抗CD3抗體E10與CD3ε肽段的結(jié)構(gòu)信息，在抗體的N端連接了CD3ε肽段作為掩蔽域，并在中間加入了MMP-2剪切位點(diǎn)的連接子。這種設(shè)計(jì)可以有效遮蔽抗CD3抗體的結(jié)合位點(diǎn)，該域能夠在腫瘤豐富的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）存在下被切割，從而恢復(fù)pro-TCE與T細(xì)胞的結(jié)合并激活T細(xì)胞，而且具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。展示了一種合理的工程方法，用于有條件地激活TCE雙特異性抗體，旨在在腫瘤環(huán)境中引起更高的治療反應(yīng)，以減少脫靶毒性。這種屏蔽策略也適用于其他抗CD3抗體克隆，表明可廣泛應(yīng)用于設(shè)計(jì)更安全的TCE雙特異性抗體。這項(xiàng)研究展示了一種開(kāi)發(fā)免疫調(diào)節(jié)療法的方法，該方法優(yōu)先考慮安全性并有可能推進(jìn)癌癥免疫治療策略。

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