一、產(chǎn)品背景與檢測原理
報告基因技術(shù)是分子生物學研究中監(jiān)測基因表達調(diào)控的重要手段。常用的報告基因包括β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因和熒光素酶基因等。其中，熒光素酶報告基因檢測體系憑借其獨特的優(yōu)勢，成為目前應(yīng)用最為廣泛的報告基因檢測方法之一。
熒光素酶報告基因檢測的主要優(yōu)勢包括：靈敏度極高、多數(shù)細胞類型內(nèi)源無熒光素酶活性背景干擾、動態(tài)范圍寬、檢測速度快以及成本較低。在眾多來源的熒光素酶中，應(yīng)用最為廣泛的是來源于北美螢火蟲（Photinus pyralis）的熒光素酶。該酶具有以下突出特點：無需翻譯后修飾即可獲得酶活性、在體內(nèi)高濃度條件下仍無明顯細胞毒性，且可在原核細胞和真核細胞中穩(wěn)定表達。
螢火蟲熒光素酶催化D-熒光素發(fā)生ATP依賴性的生物發(fā)光氧化反應(yīng)，反應(yīng)需ATP、鎂離子和氧氣的參與，發(fā)射峰值波長為560 nm的可見光。該反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光強度與熒光素酶活性呈正比，從而可準確反映報告基因的表達水平。
由艾美捷代理AAT Bioquest推出的本試劑盒（Amplite? 熒光素酶報告基因檢測試劑盒，Bright Glow）貨號：AAT-12518，采用專利配方的發(fā)光底物體系，可對活細胞及細胞裂解液中的熒光素酶活性進行定量檢測。該配方在與熒光素酶反應(yīng)后產(chǎn)生高強度的穩(wěn)定發(fā)光信號，具有持續(xù)性強、半衰期長的特點，適合動力學檢測和批量樣本讀取。試劑盒提供“混合即讀”的優(yōu)化檢測方案，與高通量篩選液體處理工作站兼容，具有極高的靈敏度，可滿足對檢測靈敏度有嚴格要求的實驗需求。
?
二、試劑盒規(guī)格與儲存條件
本試劑盒提供以下規(guī)格供選擇：
產(chǎn)品編號?| 規(guī)格（檢測次數(shù)）
Cat. #12518 | 小包裝
Cat. #12519 | 中包裝（需加入10 mL反應(yīng)緩沖液）
Cat. #12520 | 大包裝（需加入100 mL反應(yīng)緩沖液）
使用前請將所有組分置于室溫條件下解凍。對于所有發(fā)光檢測實驗，建議使用白色微孔板以獲得最佳檢測效果。
?
三、工作液配制方法
1. Cat. #12518規(guī)格：
將反應(yīng)緩沖液（Component B）全部轉(zhuǎn)移至熒光素酶傳感器（Component A）瓶中，充分混勻，即得熒光素酶傳感器工作液。
2. Cat. #12519及Cat. #12520規(guī)格：
-Cat. #12519：向熒光素酶傳感器（Component A）瓶中加入10 mL反應(yīng)緩沖液（Component B），充分混勻。
-Cat. #12520：向熒光素酶傳感器（Component A）瓶中加入100 mL反應(yīng)緩沖液（Component B），充分混勻。
-將混勻后的溶液轉(zhuǎn)移回反應(yīng)緩沖液原瓶（Component B）中，需進行多次潤洗以確保內(nèi)容物完全轉(zhuǎn)移。
> 注：配制后的熒光素酶傳感器工作液穩(wěn)定性有限，需注意避光保存，建議在配制后盡快使用。
?
四、實驗操作流程
1. 細胞（樣品）制備與化合物處理
-96孔板體系：每孔加入10 μL 10×待測化合物（溶于適宜的化合物緩沖液中），并加入細胞懸液使總體積為100 μL。
-384孔板體系：每孔加入5 μL 5×待測化合物，并加入細胞懸液使總體積為25 μL。
-空白對照孔（無細胞，僅含培養(yǎng)基）加入相應(yīng)體積的化合物緩沖液。
2. 細胞孵育
將細胞培養(yǎng)板置于37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中孵育所需時間，通常為4小時至過夜，具體時間根據(jù)實驗設(shè)計確定。
3. 加入檢測工作液
-96孔板體系：每孔加入100 μL熒光素酶傳感器工作液。
-384孔板體系：每孔加入25 μL熒光素酶傳感器工作液。
4. 孵育
室溫條件下避光孵育10～20分鐘。
5. 信號檢測
使用發(fā)光檢測儀（Luminometer）讀取發(fā)光強度值。
?
五、關(guān)鍵實驗參數(shù)
-檢測儀器：發(fā)光微孔板檢測儀（Luminometer）
-檢測波長：560 nm（峰值發(fā)射波長）
-推薦板型：白色實心底微孔板
-操作模式：混合即讀，無需洗滌步驟
?
六、實驗優(yōu)化建議
1. 細胞數(shù)量優(yōu)化：建議根據(jù)細胞類型和實驗?zāi)康膬?yōu)化每孔細胞接種密度，以確保發(fā)光信號在儀器檢測線性范圍內(nèi)。通常建議貼壁細胞每孔接種1×10?～5×10?個細胞（96孔板）。
2. 化合物處理時間優(yōu)化：不同化合物和信號通路對處理時間的要求不同，建議在正式實驗前進行時間梯度預實驗，以確定最佳孵育時間。
3. 工作液穩(wěn)定性：配制后的熒光素酶傳感器工作液對光敏感，建議現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間光照或高溫保存。
4. 板型選擇：白色微孔板可最大限度地反射發(fā)光信號，提高檢測靈敏度和信號強度。避免使用透明底或黑色微孔板進行發(fā)光檢測。
5. 背景控制：設(shè)置無細胞空白對照孔和無熒光素酶陰性對照孔，以扣除背景信號。