Amplite? 熒光法Caspase-3/7檢測試劑盒（綠色熒光），可活細(xì)胞原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測凋亡熒光酶標(biāo)儀，熒光顯微鏡多設(shè)備兼容試劑盒
一、產(chǎn)品背景與檢測原理
Caspase家族是一類在細(xì)胞凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。其中，Caspase-3（又稱CPP32/apopain）的激活是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)進(jìn)程中的關(guān)鍵事件，同時(shí)也是藥物篩選的重要靶標(biāo)。Caspase-3對底物多肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有特異性識別和剪切活性。
本試劑盒（Amplite? 熒光法Caspase-3/7檢測試劑盒，綠色熒光）采用(Z-DEVD)?R110作為熒光指示底物，用于定量檢測Caspase-3/7酶活性。其檢測原理為：高純度R110衍生底物以內(nèi)酯構(gòu)型存在時(shí)無色且無熒光。當(dāng)該底物被Caspase-3/7特異性酶切后，釋放出游離的R110熒光染料，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光信號。該熒光信號可在激發(fā)波長488 nm（熒光儀器中最常用的激發(fā)光源）、發(fā)射波長510～530 nm處進(jìn)行熒光檢測。R110衍生Caspase底物是目前廣泛應(yīng)用于Caspase家族酶活性熒光檢測的高靈敏度指示劑之一。
本試劑盒可使用熒光微孔板酶標(biāo)儀或熒光光度計(jì)，對細(xì)胞提取物和純化酶制劑中的Caspase-3活性進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，也可與流式細(xì)胞術(shù)配合使用，用于細(xì)胞凋亡分析及Caspase-3/7活性檢測。
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二、試劑盒組分與儲存條件
使用前請將各組分置于室溫條件下解凍。未使用的儲備液建議分裝為單次用量，于-20°C保存，避免反復(fù)凍融。
Caspase-3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液（1 mM）配制：
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向Ac-DEVD-CHO（Component D）瓶中加入100 μL DMSO（試劑盒不提供），充分溶解，即得1 mM Caspase-3/7抑制劑儲備液。該抑制劑可用于驗(yàn)證熒光信號強(qiáng)度與Caspase-3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。
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三、工作液配制方法
取50 μL 200× Caspase-3/7底物儲備液（Component A）和100 μL 1 M DTT溶液（Component C），加入10 mL檢測緩沖液（Component B）中，充分混勻，即得Caspase-3/7工作液。
> 注：該工作液配制量可供100次檢測使用（按每孔100 μL反應(yīng)體積計(jì)）。工作液需注意避光保存。
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四、實(shí)驗(yàn)操作流程
1. 細(xì)胞接種與化合物處理
-96孔板體系：每孔加入10 μL 10×待測化合物（溶于PBS或適宜緩沖液），并加入細(xì)胞懸液使總體積為100 μL。
-384孔板體系：每孔加入5 μL 5×待測化合物，并加入細(xì)胞懸液使總體積為25 μL。
-空白對照孔（無細(xì)胞，僅含培養(yǎng)基）加入相應(yīng)體積的化合物緩沖液。
2. 細(xì)胞孵育誘導(dǎo)凋亡
將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中孵育所需時(shí)間以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，喜樹堿處理的Jurkat細(xì)胞通常需孵育4～6小時(shí)。
3. 加入檢測工作液
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-96孔板體系：每孔加入100 μL Caspase-3/7工作液。
-384孔板體系：每孔加入25 μL Caspase-3/7工作液。
4. 孵育反應(yīng)
室溫條件下避光孵育至少1小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。
5. 抑制劑驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（可選）
如需確認(rèn)Caspase-3/7樣蛋白酶活性，可在加入Caspase-3/7工作液前，向選定樣品孔中加入1 μL 1 mM Caspase-3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液，室溫孵育10分鐘，再加入工作液進(jìn)行檢測。抑制劑處理組信號應(yīng)顯著低于未處理組。
6. R110標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（可選）
如需對Caspase-3/7反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，可將5 mM R110標(biāo)準(zhǔn)品（Component E）用生長培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，制備0～50 μM系列濃度的R110標(biāo)準(zhǔn)溶液。在熒光檢測前，向含100 μL Caspase-3/7工作液的孔中加入100 μL系列稀釋的R110標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算反應(yīng)體系中產(chǎn)物的生成量。
7. 細(xì)胞板離心（可選）
對于非貼壁細(xì)胞，可在檢測前將細(xì)胞板以800 rpm離心2分鐘（關(guān)閉剎車），使細(xì)胞沉降于孔底，以減少細(xì)胞散射對熒光信號的干擾。
8. 熒光信號檢測
使用熒光微孔板酶標(biāo)儀，在激發(fā)波長490 nm/發(fā)射波長525 nm（截止波長515 nm）處監(jiān)測熒光強(qiáng)度。
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五、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)
-檢測儀器：熒光微孔板酶標(biāo)儀（具備動(dòng)力學(xué)讀數(shù)功能）
-激發(fā)波長：490 nm
-發(fā)射波長：525 nm
-截止波長：515 nm
-推薦板型：黑色實(shí)心底微孔板
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六、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議
1. 孵育時(shí)間優(yōu)化
建議根據(jù)細(xì)胞類型和誘導(dǎo)劑活性水平進(jìn)行孵育時(shí)間梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)（0.5～3小時(shí)），以確保熒光信號處于儀器檢測的線性范圍內(nèi)。
2. 細(xì)胞接種密度優(yōu)化
建議根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化每孔細(xì)胞接種密度，通常貼壁細(xì)胞每孔接種1×10?～5×10?個(gè)細(xì)胞（96孔板），懸浮細(xì)胞每孔接種2×10?～1×10?個(gè)細(xì)胞。
3. 陽性對照與陰性對照設(shè)置
-陽性對照：使用已知Caspase-3/7誘導(dǎo)劑（如喜樹堿、Staurosporine或TRAIL）處理的細(xì)胞作為陽性對照。
-陰性對照：設(shè)置無細(xì)胞空白對照和無誘導(dǎo)劑處理的細(xì)胞對照。
-抑制劑對照：使用Ac-DEVD-CHO抑制劑預(yù)處理樣品，確認(rèn)信號特異性。
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七、注意事項(xiàng)
1. 避光操作：R110熒光染料對光敏感，工作液及反應(yīng)體系需注意避光保存和操作，避免長時(shí)間暴露于光照條件?下。
2. DTT濃度控制：DTT是維持Caspase酶活性的必要還原劑，請嚴(yán)格按照推薦濃度使用。
3. 板型選擇：熒光檢測需使用黑色實(shí)心底微孔板，以避免孔間信號串?dāng)_和背景熒光干擾。
4. 產(chǎn)物定量：如需將熒光信號轉(zhuǎn)換為酶活性絕對定量值（如產(chǎn)物摩爾數(shù)），建議制備R110標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。
5. 產(chǎn)品用途限制：本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療。