一、產(chǎn)品背景與檢測原理
Caspase家族是一類在細胞凋亡進程中發(fā)揮核心作用的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。其中，Caspase-3和Caspase-7作為效應型Caspase，在凋亡信號通路的執(zhí)行階段扮演著關鍵角色，是細胞凋亡檢測的重要分子靶標。
高純度R110（羅丹明110）衍生底物以內酯構型存在時，表現(xiàn)為無色且無熒光特性。當該底物被Caspase-3/7特異性酶切后，釋放出游離的R110熒光染料，產(chǎn)生強烈的綠色熒光信號。該熒光信號可在激發(fā)波長488 nm（熒光儀器中最常用的激發(fā)光源）、發(fā)射波長510～530 nm處進行熒光檢測。R110衍生Caspase底物是當前廣泛應用于Caspase家族酶活性熒光檢測的高靈敏度指示劑之一。
本底物（(Z-DEVD)?-R110）由艾美捷代理AAT Bioquest推出，貨號：AAT-13430，是針對Caspase-3/7的特異性熒光底物。其分子結構中包含兩個DEVD（天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸）多肽序列，與R110熒光染料偶聯(lián)形成二聚體結構。在Caspase-3/7酶活性作用下，DEVD序列被特異性剪切，釋放出游離的R110，產(chǎn)生熒光信號增強，信號強度與Caspase-3/7活性呈正比。
本產(chǎn)品經(jīng)高度純化處理，可有效消除痕量游離R110的殘留——此類微量雜質雖無法通過HPLC檢出，但足以導致顯著的檢測背景信號。高度純化的工藝確保了本底物具有極低的背景熒光和優(yōu)異信噪比。
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二、產(chǎn)品儲存與穩(wěn)定性
-儲存條件：產(chǎn)品應儲存于-15°C以下環(huán)境中，置于陰涼避光處保存。
-有效期：自收貨之日起12個月內使用有效。
-儲備液保存：未使用的儲備液建議分裝為單次用量，于-20°C保存，避免反復凍融。
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三、儲備液配制方法
(Z-DEVD)?-R110儲備液（10 mM）
向含1 mg (Z-DEVD)?-R110的瓶中加入65 μL DMSO，充分溶解，即得10 mM儲備液。
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四、工作液配制方法
Caspase-3/7檢測反應液（2×）
按以下配方混合配制2×檢測反應液：
組分?| 用量
(Z-DEVD)?-R110儲備液（10 mM） | 50 μL
DTT（1 M） | 100 μL
EDTA（100 mM） | 400 μL
Tris緩沖液（20 mM，pH 7.4） | 10 mL
充分混勻后即得2× Caspase-3/7檢測反應液，注意避光保存。
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五、實驗操作流程
1. 樣品與反應液混合
將Caspase-3/7標準品或待測樣品與等體積的2×檢測反應液充分混合。
2. 孵育反應
室溫條件下孵育至少1小時，使酶切反應充分進行。
3. 熒光信號檢測
使用熒光微孔板酶標儀，在激發(fā)波長490 nm/發(fā)射波長525 nm處監(jiān)測熒光強度隨時間的變化。建議采用動力學讀數(shù)模式，以獲取初始反應速率（V?）進行更為準確的酶活性定量分析。
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六、關鍵實驗參數(shù)
-檢測儀器：熒光微孔板酶標儀（具備動力學讀數(shù)功能）
-激發(fā)波長：490 nm
-發(fā)射波長：525 nm
-推薦板型：黑色實心底微孔板（以減少孔間信號串擾）
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七、實驗優(yōu)化建議
1. 酶量與孵育時間優(yōu)化
建議根據(jù)實驗體系中Caspase-3/7的預期活性水平，對孵育時間進行梯度預實驗（30分鐘～2小時），以確保熒光信號處于儀器檢測的線性范圍內。
2. 陽性對照設置
建議使用已知Caspase-3/7誘導劑（如Staurosporine或TRAIL）處理的細胞裂解液作為陽性對照，以確保檢測體系的有效性。
3. 背景扣除
設置無酶陰性對照孔（以等體積緩沖液替代樣品），用于扣除背景熒光信號。
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八、注意事項
1. 避光操作：R110熒光染料對光敏感，底物儲備液、工作液及反應體系均需注意避光保存和操作，避免長時間暴露于光照條件下。
2. 低溫保存：底物穩(wěn)定性與溫度密切相關，未使用的儲備液應及時轉移至-20°C保存，避免反復凍融。
3. DTT濃度控制：DTT是維持Caspase酶活性的必要還原劑，但過高濃度可能對酶活性產(chǎn)生抑制，建議嚴格按照推薦濃度使用。
4. pH控制：檢測反應液pH值應嚴格控制在7.4左右，偏離該范圍可能影響酶活性及底物反應效率。
5. 產(chǎn)品用途限制：本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療。對于潛在危險化學品的處理，請參考產(chǎn)品附帶的安全數(shù)據(jù)表（SDS）。