技術(shù)原理
本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)中的探針?lè)ㄔ怼Ｌ结?'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶的5'核酸外切酶活性會(huì)切割與靶序列結(jié)合的探針，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)當(dāng)歸樣品中目標(biāo)序列的定量和定性分析。
產(chǎn)品名稱 | 當(dāng)歸探針?lè)?/span>PCR鑒定試劑盒 | 英文名稱 | Radix Angelicae Sinensis Probe-based PCR Identification Kit |
產(chǎn)品規(guī)格 | 50T | 產(chǎn)品分類 | 熒光定量PCR |
檢測(cè)類型 | PCR檢測(cè) | 產(chǎn)品貨號(hào) | PR5145 |
產(chǎn)品特點(diǎn)
即開(kāi)即用，操作簡(jiǎn)便
高靈敏度：引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)
高特異性：針對(duì)當(dāng)歸高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，避免交叉反應(yīng)
提供陽(yáng)性對(duì)照（1×10?拷貝/μL），便于區(qū)分假陰性結(jié)果
兼容多種RNA提取方法
試劑盒組成
| 成分 | 規(guī)格 |
| 探針?lè)╭RT-PCR緩沖液 | 500μL |
| 探針?lè)╭RT-PCR酶混合液 | 100μL |
| 熒光PCR專用模板稀釋液 | 1mL |
| 當(dāng)歸探針?lè)╭RT-PCR引物混合液 | 100μL |
| 當(dāng)歸qRT-PCR探針 | 50μL |
| 當(dāng)歸探針?lè)╭RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照 | 50μL |
| 說(shuō)明書 | 1份 |
儲(chǔ)存與運(yùn)輸
運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸
保存溫度：-20℃
有效期：12個(gè)月
注意事項(xiàng)：避免反復(fù)凍融
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
自備試劑與設(shè)備
樣品RNA提取試劑
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
無(wú)核酸酶離心管和槍頭
冰盒
渦旋振蕩器
微量移液器
樣品處理要求
血清/血漿：3000rpm離心10-30分鐘分離
細(xì)胞上清液：3000rpm離心10分鐘
組織勻漿：加入生理鹽水勻漿后離心
保存：如不立即檢測(cè)，應(yīng)分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融
操作步驟
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（以6個(gè)10倍稀釋度為例）
標(biāo)記6個(gè)離心管（7-2號(hào)）
每管加入45μL模板稀釋液
7號(hào)管加入5μL陽(yáng)性對(duì)照（1×10?拷貝/μL），震蕩混勻，得到1×10?拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品
依次稀釋至1×102拷貝/μL
RNA提取
建議使用柱式病毒RNA提取試劑盒，或兼容的其他RNA提取方法
PCR反應(yīng)體系（20μL）
| 成分 | 樣品管(N+2) | 陰性對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線管 |
| qRT-PCR緩沖液 | 各10μL | 10μL | 各10μL |
| qRT-PCR酶混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL |
| qRT-PCR探針 | 各1μL | 1μL | 各1μL |
| 引物混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL |
| RNA模板 | 各5μL | - | - |
| 超純水 | - | 5μL | - |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | - | - | 各5μL |
PCR反應(yīng)程序
| 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30min | 1 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 10min | 1 |
| 變性 | 94℃ | 15sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1min | 40 |
| 信號(hào)采集 | 60℃ | - | 40 |
結(jié)果分析
定量分析
以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，Ct值為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
根據(jù)樣品Ct值推算RNA濃度
定性分析
陰性對(duì)照：Ct≥40或無(wú)Ct值
陽(yáng)性對(duì)照：Ct≤30，有明顯擴(kuò)增曲線
樣品判定：
Ct<35：陽(yáng)性
Ct≥40：陰性
35≤Ct<40：需重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)
注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)分區(qū)操作，避免污染
使用帶濾芯槍頭
反應(yīng)體系配制應(yīng)在冰上進(jìn)行
陽(yáng)性對(duì)照最后加入
本產(chǎn)品僅限科研使用
避免反復(fù)凍融試劑
質(zhì)量控制
陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)擴(kuò)增（Ct≥40）
陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)有明顯擴(kuò)增曲線且Ct≤30
標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)≥0.98
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