商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 單寧酶（TAN）測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961178 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氧化與抗氧化系列 |
測試方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
單寧酶（Tannase，EC 3.1.1.20）是一種水解酶，其測定具有重要的實際意義：食品工業(yè)：用于果酒、果汁加工，降低單寧含量，改善口感茶葉加工：提高茶葉品質(zhì)，減少苦澀味，提高水溶性物質(zhì)浸出率飼料工業(yè)：降低飼料中單寧含量，提高飼料營養(yǎng)價值環(huán)境保護：處理含單寧的工業(yè)廢水，降低COD和BOD生物制藥：用于生產(chǎn)沒食子酸等醫(yī)藥中間體
測定原理
采用沒食子酸標準曲線法，單寧酶催化單寧酸水解生成沒食子酸和葡萄糖，在堿性條件下，沒食子酸與福林-酚試劑反應產(chǎn)生藍色化合物，在760nm處有最大吸收峰，吸光度與沒食子酸含量成正比，間接反映單寧酶的活性。 單寧酸+H2O→單寧酶沒食子酸+葡萄糖單寧酸+H2O單寧酶沒食子酸+葡萄糖
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑A 液體30mL×1瓶 含0.1mol/L pH5.0醋酸鹽緩沖液，提供酶促反應環(huán)境
試劑B 液體10mL×1瓶 含1%單寧酸溶液，酶促反應底物
試劑C 液體10mL×1瓶 含10%鎢酸鈉溶液，終止反應
試劑D 液體10mL×1瓶 含20%碳酸鈉溶液，顯色反應緩沖液
試劑E 液體5mL×1瓶 含福林-酚試劑，顯色反應試劑
標準品 液體1mL×1支 含10mmol/L沒食子酸標準品，用于建立標準曲線
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法：可見分光光度計（760nm檢測通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶標儀（760nm檢測通道）、96孔板
通用：低溫離心機（≥8000g）、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、漩渦混勻器
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、酶提取液（0.1mol/L pH5.0醋酸鹽緩沖液）
樣本前處理方法
微生物發(fā)酵液樣本取發(fā)酵液8000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測定若酶活性過高，用試劑A稀釋1-10倍后測定樣本可-20℃保存3個月，避免反復凍融
動植物組織樣本取新鮮組織約0.1g，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分加入1mL酶提取液，冰浴勻漿8000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測定
食品樣本茶葉：取干燥茶葉0.05g，加入1mL酶提取液，40℃水浴浸提30min果汁/果酒：取樣本1mL，加入1mL酶提取液，振蕩混勻8000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測定
化妝品/飼料樣本取樣本0.1g，加入1mL酶提取液，振蕩混勻37℃水浴提取30min，期間振蕩2-3次8000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測定
測定操作步驟
標準曲線建立將10mmol/L沒食子酸標準品用蒸餾水稀釋成0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mmol/L系列濃度取比色管，加入標準品溶液0.5mL + 試劑C 0.2mL + 試劑D 2.0mL + 試劑E 0.5mL，混勻37℃水浴反應30min，760nm波長下測定吸光度以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線
樣本測定
酶促反應：
取比色管，加入樣本0.5mL + 試劑B 0.5mL，混勻
37℃水浴反應30min，加入試劑C 0.2mL終止反應
空白管：加入樣本0.5mL + 試劑C 0.2mL + 試劑B 0.5mL，同樣處理
顯色反應：
向反應管和空白管中加入試劑D 2.0mL + 試劑E 0.5mL，混勻
37℃水浴反應30min，760nm波長下測定吸光度
微量法操作取96孔板，加入樣本25μL + 試劑B 25μL，混勻37℃恒溫孵育30min，加入試劑C 10μL終止反應加入試劑D 100μL + 試劑E 25μL，混勻，37℃孵育30min酶標儀760nm波長下測定吸光度
結(jié)果計算方法
單位定義
U/mL：每毫升樣本中，每分鐘催化生成1μmol沒食子酸的酶量
U/g：每克樣本中，每分鐘催化生成1μmol沒食子酸的酶量
kat：每秒催化轉(zhuǎn)化1摩爾底物的酶量（1kat=60×10?U）
計算公式
單寧酶活性(U/mL)=(A樣?A空)×C標×V總(A標?A空標)×t×V樣單寧酶活性(U/mL)=(A標?A空標)×t×V樣(A樣?A空)×C標×V總
A樣-A空：樣本扣除空白后的吸光度值
C標：標準品濃度（μmol/mL）
V總：酶促反應總體積（mL）
A標-A空標：標準品扣除空白后的吸光度值
t：反應時間（min）
V樣：樣本加入體積（mL）
簡化公式
按體積計算：單寧酶活性（U/mL）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標) × V總/(t × V樣)
按質(zhì)量計算：單寧酶活性（U/g）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標) × V總/(t × W)
性能指標
指標 要求
線性范圍 0~10mmol/L沒食子酸當量，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測限 ≤0.05U/mL
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月，活性保留≥90%
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶活性失活；-20℃可保存3個月
酶提取液需用pH5.0醋酸鹽緩沖液，避免過酸或過堿影響酶活性
樣本中不能添加重金屬離子，以免抑制酶活性
試劑使用：
單寧酸溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免分解
福林-酚試劑需避光保存，避免氧化
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
測定過程：
反應溫度需嚴格控制在37℃，反應時間30min
終止反應后需立即加入顯色試劑，避免酶促反應繼續(xù)進行
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 單寧酶;TAN;測試盒;
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