商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 二氫黃酮醇還原酶（DFR）測(cè)試盒 | 產(chǎn)品貨號(hào) | BH-961181 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氧化與抗氧化系列 |
測(cè)試方法 | 微量法、可見(jiàn)分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測(cè)定意義與原理
測(cè)定意義
二氫黃酮醇還原酶（DFR）是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，其測(cè)定具有重要的實(shí)際意義：植物生理學(xué)：決定植物花色、葉色、果色等性狀的關(guān)鍵因素食品科學(xué)：影響水果、蔬菜、茶葉等的色澤和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)生物技術(shù)：用于植物基因工程和代謝工程研究農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：培育高黃酮含量作物和觀賞植物新品種醫(yī)藥研究：黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性
測(cè)定原理
二氫黃酮醇還原酶作用于二氫槲皮素產(chǎn)生兒茶素，可與香草醛縮合形成紅色化合物，在500nm處有最大吸收峰，吸光度與酶活性成正比。反應(yīng)式如下： 二氫槲皮素+NADPH→DFR兒茶素+NADP++H2O二氫槲皮素+NADPHDFR兒茶素+NADP++H2O
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
試劑一 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液，提供酶促反應(yīng)環(huán)境
試劑二 液體10mL×1瓶 含2mmol/L二氫槲皮素溶液，酶促反應(yīng)底物
試劑三 液體1.5mL×1瓶 含10mmol/L NADPH溶液，酶促反應(yīng)輔因子
試劑四 液體25mL×1瓶 含5%香草醛溶液，顯色反應(yīng)試劑
試劑五 液體25mL×1瓶 含濃鹽酸，顯色反應(yīng)試劑
標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1支 含10mg兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法：可見(jiàn)分光光度計(jì)（500nm、340nm檢測(cè)通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶標(biāo)儀（500nm、340nm檢測(cè)通道）、96孔板
ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測(cè)通道）、96孔板
通用：低溫離心機(jī)（≥10000g）、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽/組織勻漿器
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液
樣本前處理方法
植物組織樣本取新鮮植物組織約0.1g，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液，冰浴勻漿10000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測(cè)定
微生物發(fā)酵液樣本取發(fā)酵液10000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測(cè)定若酶活性過(guò)高，用試劑一稀釋1-10倍后測(cè)定樣本可-20℃保存3個(gè)月，避免反復(fù)凍融
食品樣本茶葉：取干燥茶葉0.05g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液，40℃水浴浸提30min水果/蔬菜：取樣本0.1g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液，冰浴勻漿10000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測(cè)定
細(xì)胞樣本收集500萬(wàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，8000g 4℃離心5min棄上清加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液，冰浴超聲波破碎（功率20%或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次）10000g 4℃離心10min，取上清液作為粗酶液直接測(cè)定
測(cè)定操作步驟
分光光度法操作
酶促反應(yīng)：
取比色管，加入樣本0.5mL + 試劑二0.2mL + 試劑三0.1mL，混勻
37℃水浴反應(yīng)30min
空白對(duì)照：取樣本0.5mL + 試劑一0.3mL，同樣處理
顯色反應(yīng)：
向各管加入試劑四0.2mL + 試劑五0.2mL，渦旋混勻，室溫靜置15min
在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管吸光度
ELISA法操作樣本處理：將樣本稀釋至合適濃度（5-160U/mL）加樣：取96孔板，加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL + HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體100μL，37℃溫育60min洗滌：棄去液體，洗滌5次，每次300μL顯色：加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：加入終止液50μL，15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度
結(jié)果計(jì)算方法
單位定義
U/g 鮮重：每克植物組織鮮重中DFR酶的活性
U/L：每毫升發(fā)酵液/血清中DFR酶的活性
U/mg prot：每毫克蛋白質(zhì)中DFR酶的活性
計(jì)算公式
DFR酶活性(U/g鮮重)=(A樣?A空)×C標(biāo)×V總(A標(biāo)?A空標(biāo))×t×WDFR酶活性(U/g鮮重)=(A標(biāo)?A空標(biāo))×t×W(A樣?A空)×C標(biāo)×V總
A樣-A空：樣本扣除空白后的吸光度值
C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL）
V總：樣本提取液總體積（mL）
A標(biāo)-A空標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品扣除空白后的吸光度值
t：反應(yīng)時(shí)間（min）
W：樣本質(zhì)量（g）
ELISA法計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)計(jì)算樣本濃度：將樣本吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算DFR濃度結(jié)果換算：DFR活性（U/L）= 樣本濃度（ng/mL）× 換算系數(shù)（根據(jù)試劑盒說(shuō)明書）
性能指標(biāo)
指標(biāo) 要求
線性范圍 0~10μmol/L兒茶素當(dāng)量，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測(cè)限 ≤0.01U/g鮮重
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個(gè)月，活性保留≥90%
注意事項(xiàng)
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶活性失活；-20℃可保存3個(gè)月
酶提取液需用pH7.5 Tris-HCl緩沖液，避免過(guò)酸或過(guò)堿影響酶活性
樣本中不能添加重金屬離子，以免抑制酶活性
試劑使用：
NADPH溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化
香草醛溶液需避光保存，避免分解
不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定過(guò)程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃，反應(yīng)時(shí)間30min
顯色反應(yīng)后需立即測(cè)定，2小時(shí)后吸光度值會(huì)下降
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測(cè)定
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
公司正在出售的產(chǎn)品
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關(guān)鍵字： 二氫黃酮醇還原酶;DFR;測(cè)試盒;
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