遲鈍愛德華菌染料法熒光定量PCR試劑盒
商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 遲鈍愛德華菌染料法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Edwardsiella tarda Dye-based qPCR Kit |
規(guī)格 | 50T | 貨號 | PR4533 |
產(chǎn)品概述
遲鈍愛德華菌是一種人-魚共患的革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于水體環(huán)境中，可引發(fā)魚類大量死亡及人類感染。本試劑盒以染料法熒光定量PCR技術(shù)為核心，基于該菌高度保守的基因序列設(shè)計引物，能實現(xiàn)對樣本中遲鈍愛德華菌核酸的快速定性與定量檢測，適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測、公共衛(wèi)生病原篩查及相關(guān)科研工作。
產(chǎn)品特點
操作便捷：即開即用，用戶僅需提供樣本DNA模板，無需額外配制核心試劑
高特異性：引物針對遲鈍愛德華菌保守區(qū)域設(shè)計，與其他近緣微生物無交叉反應(yīng)
高靈敏度：檢測下限可達(dá)100-1000拷貝/反應(yīng)
寬線性范圍：定量檢測線性范圍覆蓋5個以上數(shù)量級
雙重功能：可同時滿足定性篩查與精確定量檢測需求
污染防控：一管式封閉反應(yīng)體系，有效避免產(chǎn)物污染
包裝規(guī)格及成分
組分名稱 規(guī)格 包裝標(biāo)識
2×qPCR MagicMix（含染料） 1mL 紅蓋管
超純水 1mL 亮黃蓋管
引物混合液 100μL 白蓋管
陽性對照（1×10?拷貝/μL） 50μL 黃蓋管
DNA抽提液（試用裝） 9mL（15次用量） 透明管
使用手冊 1份 -
運輸與保存條件
運輸：采用冰袋低溫運輸，避免凍融循環(huán)
保存：-20℃避光保存，有效期12個月
注意：陽性對照需單獨存放，避免污染其他試劑；2×qPCR MagicMix避免反復(fù)凍融，頻繁使用可分裝后4℃短期存放（不超過1個月）
自備材料與儀器
材料：一次性無酶離心管、帶濾芯吸頭、一次性手套、口罩
儀器：熒光定量PCR儀、高速離心機、金屬浴/PCR儀（用于核酸提?。?、移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
實驗操作步驟
步驟1：陽性對照梯度稀釋（用于定量檢測）
標(biāo)記6個離心管為2-7號
每管加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液
7號管加入5μL陽性對照，充分震蕩1分鐘，得到1×10?拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品
依次倍比稀釋得到1×10?、1×10?、1×10?、1×103、1×102拷貝/μL的系列標(biāo)準(zhǔn)品，全程換用新吸頭，操作區(qū)與樣本區(qū)嚴(yán)格分離
步驟2：樣本DNA提取
可使用試劑盒配套的DNA抽提液或商業(yè)化核酸提取試劑盒，以下為配套抽提液操作方法：
液體培養(yǎng)物：取100μL培養(yǎng)物→8000rpm離心3min→棄上清→加50μL抽提液混勻→100℃加熱10min→13000rpm離心3min→取5μL上清作為模板
固體菌落：挑取單菌落→加入50μL抽提液混勻→100℃加熱10min→13000rpm離心3min→取5μL上清
糞便/組織樣本：取適量樣本→加0.5mL生理鹽水混勻→13000rpm離心3min→棄上清→后續(xù)操作同液體培養(yǎng)物
環(huán)境水樣：取2-3mL水樣→13000rpm離心3min→棄上清→后續(xù)操作同液體培養(yǎng)物
步驟3：熒光定量PCR反應(yīng)體系配制（20μL體系）
組分 樣品管/陰性對照管 陽性對照管（標(biāo)準(zhǔn)品）
2×qPCR MagicMix 10μL 10μL
引物混合液 2μL 2μL
樣本DNA/超純水 8μL -
系列標(biāo)準(zhǔn)品/超純水 - 8μL
?? 注意：陰性對照用超純水替代模板；先配制樣品管與陰性對照，最后添加陽性對照，避免污染
步驟4：PCR反應(yīng)程序設(shè)置
階段 溫度 時間 循環(huán)數(shù)
預(yù)變性 95℃ 5min 1
擴增循環(huán) 95℃ 10sec 40
60℃ 30sec（采集熒光）
?? 注意：熒光信號采集通道選擇FAM通道（染料最大發(fā)射波長530nm），可根據(jù)儀器型號微調(diào)退火溫度
結(jié)果判讀
定量檢測
以陽性對照濃度的對數(shù)為橫軸，Ct值為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
根據(jù)樣品Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對應(yīng)核酸濃度
標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.99，否則需重新實驗
定性檢測
陰性對照Ct值≥40且無擴增曲線
陽性對照Ct值≤30且有典型S型擴增曲線
待測樣品判讀標(biāo)準(zhǔn)：
Ct值≤35：陽性
35<Ct值<40：重復(fù)實驗，若仍<40則判為陽性
Ct值≥40：陰性
常見問題及解決方法
常見問題 可能原因 解決方法
所有樣品均無擴增曲線 試劑失活/操作失誤 檢查試劑保存條件，重新配制反應(yīng)體系
陽性對照正常，樣品無擴增 模板降解/濃度過低 使用新鮮樣本，優(yōu)化模板加入量（5-15%體系）
非特異性擴增嚴(yán)重 退火溫度過低/引物濃度高 提高退火溫度，優(yōu)化引物用量
陰性對照出現(xiàn)擴增曲線 交叉污染 更換無菌耗材，嚴(yán)格分區(qū)操作，加強實驗室消毒
注意事項
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實驗全程佩戴手套口罩，使用無菌耗材，避免交叉污染
反應(yīng)體系配制需在冰上操作，避免試劑反復(fù)凍融
PCR儀可能需要優(yōu)化反應(yīng)程序，建議進行溫度梯度預(yù)實驗
樣本采集后應(yīng)盡快處理，-20℃保存不超過1個月，避免反復(fù)凍融
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關(guān)鍵字： 遲鈍愛德華菌;染料法熒光定量;PCR試劑盒;
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